专利名称：一种检测秦川牛ampd1基因连锁突变的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及基因单核苷酸多态性(SNPs)的检测，特别涉及一种快速检测秦川牛腺苷一磷酸脱氨酶1 (AMPDl)基因内含子11区域第19416位和第 19421位单核苷酸多态性的PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)方法，该方法利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行检测，并对其进行片段分离，利用凝胶成像系统分析其片段多态性，再结合测序技术，从而准确确定其SNPs。
背景技术：
通过对SNP进行分析，我们可以从遗传学的角度来很好的解释个体表型所造成的差异。SNP和其他分子标记相比较而言，分辨率最高也最为丰富，几乎可以覆盖到整个基因组范围，遗传上相对比较稳定。在动物基因组中SNP分布广泛，每一个核苷酸发生突变的概率大约为10_9，编码区位置可发生突变，5'端、3'端、非编码区以及内含子区域也可以发生突变。虽然SNP的检测方法有很多种，但是各有其自身的特点，而且大多数方法以聚合酶链式反应为主要基础，利用碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行SNP检测和分析。目前，实验室工作人员主要采用以下几种不同的方法来发现SNPs:即直接测序法、PCR-RFLP法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNPs检测技术中，直接测序法是最为准确的SNPs检测方法，测序法检测单核苷酸多态性的效率可以达到100%。但是，因为需要用到专门的大型测序仪器，而且需要有熟练操作仪器的技术工作人员，还需要有丰富的测序经验，更为重要的是直接测序的检测费用极其昂贵，对实验人员来说，直接测序无疑不是一种应用于生产实际的理想SNPs检测方法；PCR-RFLP法是利用限制性内切酶可以识别DNA特异位点，并可在特异位点进行识别切割的特点，将其切割成不同大小的片段，从而来判断其多态性。这种检测方法准确，重复性高，但是碱基的替换、插入、缺失可以产生或者消除一个特定的酶切位点，从而改变了用这种酶切割之后产生片段的大小和数目，所以当遇到没有合适的内切酶可以直接切割特异位点时，这种方法就显得无能为力；AS-PCR方法作为一种新型的SNPs检测方法，在未来的应用领域中具有非常的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNPs位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，现有的几种方法均不是一种检测SNPs的理想的遗传标记方法。而基于 PCR的单链构象多态性是以构象为基础的检测基因组中单核苷酸突变的方法。它的基本原理是单链DNA片段呈现复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该技术以其高度的灵敏性(甚至一个碱基的改变也可通过不同的带型检测出来)、操作的简便性(整个实验过程在1 2小时内就能完成)和应用范围的广泛性， 已成为人类和动物遗传育种中快速、灵敏探测已知基因突变位点，识别未知基因突变的一项新技术。AMPD属于多基因家族，其成员有三个，AMPDl是家族成员之一。AMPDl基因存在于所有的真核生物中，但主要是在肌肉中表达，特别是在骨骼肌中高水平的进行表达，并且与肌肉中肌苷酸代谢有关。目前，关于动物AMPDl基因遗传变异的研究国内外主要集中在鼠、 鸡和猪等动物上，未见牛AMPDl基因遗传变异或SWs研究的相关报道。目前中国地方黄牛， 特别是秦川牛AMPDl基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因的功能研究及其遗传变异与生长和胴体性状(如体高、体斜长、腰角宽、空腹24h宰前活重、胴体重、屠宰率等性状)关联的研究仍是空白。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题和缺点，本发明的目的在于提供一种检测秦川牛 AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，该检测方法操作简单、快速、成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。为了实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现一种检测秦川牛AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，以包含AMPDl基因的待测秦川牛全基因组 DNA 序列为模板,在 2XReaction Mix、ddH20、Forward primer、Reverse primer,Golden DNA polymerase、DNA模板存在的情况下，设计聚合酶链式反应引物，在PCR 反应程序下进行扩增，扩增后将PCR产物放于98°C高温下变性lOmin，从而使DNA双链充分变性为DNA单链。然后再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析，并鉴定其多态片段，得秦川牛AMPDl基因第11内含子区域第19416位和第19421 位分别发生了 T > C和A > G的单核苷酸多态性。所述的聚合酶链式反应引物为上游引物5'-AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ；下游引物5'-GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。所述的PCR 反应程序为95°C预变性 5min，94°C 30s，60°C 40s, 72°C 40s，共 36 个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。所述的PCR反应体系是15 μ L反应体系包括ddH20 6. 1 μ L，2XReaction Mix 7· 5 μ L，上游引物 0· 3 μ L，下游引物 0· 3 μ L，Golden DNA polymerase 0. 2 μ L，含 AMPDl 基因序列的DNA模板0.6 μ L。所述的检测AMPDl基因单核苷酸多态性的方法，聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为 10%。本发明根据AMPDl基因的序列设计引物，以秦川牛的基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到秦川牛的AMPDl基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较发现在g. 19416T > C和g. 19421A > G两个位置存在SNPs多态性。针对上述的SNPs多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，构建混合DNA样品池，PCR扩增，扩增产物直接测序，特定的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定， 能够简单、快速、低成本、精确的检测其单核苷酸的多态性。
本发明对秦川牛的SNPs基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNPs位点与秦川牛生长和胴体性状进行关联分析，结果表明该连锁突变位点能够作为秦川牛生长和胴体性状的分子标记。
图1为秦川牛血样基因组DNA电泳检测图。图2为秦川牛AMPDl基因第11内含子PCR产物1. 5%琼脂糖凝胶电泳图。图3为秦川牛AMPDl基因第11内含子PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。下面结合
和发明人给出的最佳实施方式对本发明做进一步的详细说明， 以使公众对发明内容从整体上得到充分的理解，而并非对本发明保护范围的限定。
具体实施例方式以下实施例中所用的主要试剂来源一、常用实验试剂柠檬酸，柠檬酸钠，葡萄糖，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，乙二氨四乙酸二钠，琼脂糖，盐酸，硼酸，氢氧化钠，蔗糖，氯仿，硝酸银，丙烯酰胺，甲醛，Tris饱和酚，二甲基苯青FF，Tris，十二烷基磺酸钠，无水乙醇，溴酚蓝，N, N’ -亚甲双丙烯酰胺，去离子甲酰胺，TEMED，核酸染料，蛋白酶K，DNA聚合酶，DNA Marker I，PCR产物胶回收试剂盒等，均购自北京天根生化科技有限公司。二、试剂和溶液的配制试剂和溶液的配制方法具体如下(I)ACD 抗凝剂柠檬酸2. 4g，柠檬酸钠6. 6g，葡萄糖7. 35g，加水定容至50mL蒸馏水中，采集血样时，在新鲜血液中按一定比例加入A⑶。A⑶在血液贮存过程中能更好地保存DNA的天然状态。O) PBS 缓冲液NaCl 4g，KCl 0. lg, Na2HPO4O. 72g，KH2PO4O. 12g，加灭菌过的蒸馏水定容至 500mL， 用pH试纸调pH至7. 4，120°C高压灭菌20min。(3)0. 5mol/L EDTA称量186. Ig乙二胺四乙酸二钠倒入500mL灭菌蒸馏水中，在磁力搅拌器上搅拌使其溶解，溶解后定容至IOOOmL,用NaOH溶液调节pH值到8.0，120°C高压灭菌20min。G) DNA 抽提液分别量取lmmol/L Tris · Cl IOOmL, 5mmol/L NaCl 40mL，0. 5mmol/LEDTA 400mL, 10%十二烷基磺酸钠lOOmL，定容至1000mL。pH值用NaOH调为8. 0。⑶蛋白酶K加5mL灭菌蒸馏水，稀释成20mg/mL，放入_20°C保存备用。(6) 70% 乙醇
无水乙醇350mL，加蒸馏水150mL定容至500mL。(7) 10XTBE 缓冲液称取Tris 54g,硼酸27. 5g，EDTA · Na23. 72g，加热混勻，保存备用。(幻40%的蔗糖水溶液40g蔗糖加入60g灭菌水中溶解，保存于4°C冰箱。(9) SSCP垂直电泳上样缓冲液0. 025%溴酚蓝，0. 025% 二甲基苯青FF，40%的蔗糖水溶液。(10) SSCP 变性剂95% 的去离子甲酰胺 9. 8mL，0. 5mol/L EDTA(调 pH = 8. 0) 200 μ L，二甲苯青 FF 100 μ L，溴酚蓝 100 μ Lo(11) 30% 丙烯酰胺称取丙烯酰胺29g和N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺Ig加水至IOOmL,加热使完全溶解，置于棕色瓶中4°C条件下保存备用。配溶液时需戴手套，以防止丙烯酰胺的神经毒性作用。(1 10%过硫酸铵IOg过硫酸铵放入IOOmL灭菌水中，充分溶解后放入4°C储存。最好现用现配。(13)染色液称取0. 5g硝酸银溶于500mL双蒸水中，棕色瓶保存以避免硝酸银发生氧化。(14)显色液称IOg氢氧化钠，0. 2g无水碳酸钠溶解于500mL双蒸水中，用前加750 μ L甲醛。三、软件工具(1)引物设计软件Primer Premier 5. 0软件结合Oligo 6. 0软件自行设计引物；(2)序列分析软件BioXM (Version 2. 6)软件和DNA Star 7. 10软件进行序列比对和突变位点分析；(3)统计分析软件EXCELL用于数据统计；SPASS 16. 0进行各性状指标的统计和分析，以及差异显著性检验。实施例1 秦川牛样本采集、基因组DNA提取以及DNA样品池的构建一、实验动物的采集2008年9月至11月在陕西省秦宝牧业发展有限公司，从秦川牛群体中随机选取 30士2月龄的公牛屠宰，共采集秦川牛血样215份。15mL全血中加入0. 5mL的A⑶抗凝剂， 上下颠倒混勻后置于冰盒中带回实验室，样品放于-80°C保存备用。二、牛血样基因组DNA的提取过程血样基因组DNA的提取，具体操作如下(1)将血样从_80°C取出后，放于常温下让其慢慢的融化；在半冻融状态下开始吸取800 μ L的血液于^iiL的灭过菌的离心管中；(2)再从PBS缓冲液中吸取800 μ L，使总体积达到1600 μ L，轻轻摇动IOmin ；(3)低温下，12000rpm 离心 IOmin ；
(4)弃上清，重复上面的步骤，直到上清液变的清亮；(5)加入DNA抽提液800 μ L，缓慢摇动IOmin,于37°C水浴1. 5h ；(6)加蛋白酶K 5 μ L，混勻后在恒温水浴箱中57°C过夜消化蛋白质等，当溶液变得澄清透明时，便可拿出；(7)加入800 μ L的Tris饱和酚，放在冰上温和摇动15min ；(8)低温下，12000rpm 离心 IOmin ；(9)用大口径枪头小心吸取上清液到灭菌的离心管中；(10)加入400 μ L的Tris饱和酚和400 μ L的氯仿，放在冰上温和摇动15min ；(11)低温下，12000rpm 离心 IOmin ；(12)用大口径枪头小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中；(13)加入800 μ L的氯仿，放在冰上温和摇动15min ；(14)低温下，12000rpm 离心 IOmin ；(15)用大口径枪头小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中；(16)加入至少2倍体积的无水乙醇，上下颠倒数次使DNA析出；(17)低温下，12000rpm离心lOmin，弃去乙醇；(18)加入70%的乙醇lmL，温和摇动IOmin ；(19)低温下，12000rpm离心lOmin，如有需要视情况可重复漂洗一次；(20)室温下让乙醇挥发干净，加入一定量灭菌水溶解DNA，完全溶解后测定浓度和纯度。三、紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度以50ng/ μ L作为标准DNA浓度，若测得的DNA浓度在50ng/ μ L左右，说明DNA 浓度符合实验要求；浓度过高的需要稀释成标准浓度；浓度过低的需重新提取DNA。若A26Qnm/A28Qnm比值在1. 6_2. O之间时，可判定DNA的纯度基本符合要求。若 A260nm/A280nm比值小于1. 6或者大于2. O时，可判定纯度不符合要求。必须对样品DNA做进一步的纯化，或重新提取DNA。四、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量(1)将凝胶电泳槽洗干净，插上梳子。(2)称取0.5g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入IXTBE 20mL使其悬浮，微波炉加热 70秒，待溶液沸腾呈透明状时拿出。(3)待三角瓶内液体温度不烫手时，按10 1的比例加入2μ L核酸染料，轻微摇动，防止出现气泡。(4)混勻后，立即将琼脂糖溶液倒入槽内。如出现气泡，立即用针头或干净的小枪头将气泡挑破。(5)放置一段时间后，用手触摸(戴手套)如果完全冷却凝固，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中。(6)向电泳槽中加入1 XTBE缓冲液，使液面高出胶面5mm。(7)取DNA样品3yL，加3μ L上样缓冲液后，混勻上样。(8) IOOV 电压电泳 Ih。(9)在凝胶成像系统上观察，如果电泳条带清晰而规则，没有明显拖尾现象，说明提取的DNA效果较好，可以满足实验需要，否则需重新提取相应样品的DNA。五、混合DNA样品池的构建本实验混合DNA样品池的构建方法如下将提取的基因组DNA，用紫外分光光度计测量每个DNA样品浓度各3次，取平均值，再将样品稀释到终浓度为50ng/ μ L，10个DNA样品中各取2 μ L快速构建成DNA池。以池中DNA样品为模板进行扩增，并送去测序，快速筛查基因的SNPs。结果秦川牛血样基因组DNA的检测结果见图1。实施例2 秦川牛AMPDl基因第11内含子的PCR扩增一、秦川牛AMPDl基因第11内含子PCR引物的设计以NCBI数据库中GenBank公布的牛(登录号NC_007301)序列为参考，利用 Premier 5.0软件结合Oligo 6. 0软件设计秦川牛AMPDl基因第11内含子的PCR引物(片段大小为，其引物序列如下上游引物5' -AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ；下游引物5' -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。该引物对扩增了秦川牛AMPDl基因第11内含子区域。二、PCR 扩增(I)PCR反应体系PCR反应体系采用混合加样法，实验中我们通常是先计算出每一种成份所需要的量，然后再算出加样总量，之后均等分装到每一个PCR管，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。PCR反应体系如表1。表IPCR反应体系
(2) PCR反应程序
PCR反应程序见表2
表2PCR反应程序
权利要求
1.一种检测秦川牛AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，其特征在于，以包含AMPDl 基因的待测秦川牛全基因组DNA序列为模板，在2XReaction Mix^ddH2O,Forward primer、 Reverse primer,Golden DNA polymerase、DNA模板存在的情况下，设计聚合酶链式反应引物，在PCR反应程序下进行扩增，扩增后对PCR产物进行变性，然后再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析，并鉴定其多态片段，得秦川牛AMPDl基因第11内含子区域第19416位和第19421位分别发生了 T > C和A > G的单核苷酸多态性；所述的聚合酶链式反应引物为 上游引物5' -AACCCTCAGGCTCACCCA-3‘ 18bp ； 下游引物5 ‘ -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3‘ 18bp。
2.根据权利要求1所述的检测秦川牛AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，其特征在于，所述的PCR反应程序为95°C预变性 5min，94°C 30s，60°C 40s，72°C 40s，共 36 个循环，最后 72°C延伸 10min，4°C保存。
3.根据权利要求1所述的检测秦川牛AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为总体积为15μ L的反应体系，包括2 X Reaction Mix 7. 5 μ L，ddH20 6. 1 μ L，上游引物 0. 3 μ L，下游引物 0. 3 μ L，Golden DNA polymerase 0. 2 μ L，含 AMPDl 基因序列的 DNA 模板 0. 6 μ L0
4.根据权利要求1所述的检测秦川牛AMPDl基因连锁突变的PCR-SSCP方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%。
全文摘要
本发明公开了一种检测秦川牛AMPD1基因连锁突变的PCR-SSCP方法，该方法是以包含AMPD1基因的待测秦川牛全基因组DNA序列为模板，在2×Reaction Mix、ddH2O、Forward primer、Reverse primer、Golden DNApolymerase、DNA模板存在的情况下，设计聚合酶链式反应引物，在PCR反应程序下进行扩增，扩增后对PCR产物进行变性，然后再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用凝胶成像系统分析其片段，从而确定其单核苷酸多态性。该检测方法操作简单、快速、成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102363803SQ20111011770
公开日2012年2月29日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者刘小林, 张慧林, 贺花 申请人:西北农林科技大学