专利名称：降香黄檀籽提取物制备及其抗凝活性快速筛选的方法
技术领域：
本发明涉及降香黄檀籽提取物的制备方法以及利用纤维蛋白原和凝血酶模型，建立一种体外快速筛选降香黄檀籽抗凝提取物的方法，属于保健食品、生物和医药领域。
背景技术：
心脑血管疾病死亡目前占我国城市居民死亡总数的44%以上，居1-2位，严重危害人类的健康，血栓形成是其中一种常见病因。血栓是指血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变的流体依赖型中，血栓由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。在生理状态下，血液在血管中循环流动，既不溢出血管之外导致出血，也不会在血管中凝固成血栓，这主要是由于体内存在着复杂的凝血系统和抗凝系统，而且二者维持动态平衡，一旦这种平衡遭到破坏，则可能发生出血性或者血栓性疾患。纤维蛋白原是一种血浆蛋白质，主要分布在血浆中参与血液凝固、纤溶、抗纤溶过程，纤维蛋白作为凝血反应的最终产物，也是血栓的主要成分。纤维蛋白溶解系统简称为纤溶系统，其主要作用是将沉积在血管内外的纤维蛋白原溶解，起到修复、去除和防止血管内由于纤维蛋白沉着引起的阻塞作用。血液中存在无活性的纤溶酶原，当它被纤溶酶原激活物激活后变成诱惑性的纤溶酶，纤溶酶将纤维蛋白原、纤维蛋白分解为纤维蛋白降解产物 (FDP)。除以上促纤溶物质外，血液中还存在对抗激活纤溶的物质，如纤溶酶原激活物抑制剂、抗纤溶酶等。在正常情况下，机体内二者处于动态平衡。血栓的发病率高，形成机理复杂，与血管内皮细胞、血小板活性、系统内凝血因子等有关，是目前国内外医药学家研究的热点。目前抗血栓药物的研究主要集中在抑制血小板聚集、抗凝血、溶解纤维蛋白原等功能。从天然植物中提取生物活性成分是天然药物学和保健食品学的研究热点，它既是寻找天然无毒副作用药物的有效途径，也是保健食品功能因子的研究目的之一。降香黄檀属豆科、蝶形花亚科、黄檀属植物，别名黄花梨、花梨母、降香檀等，是我国特有的珍贵红木树种之一，天然仅分布于海南省的中部和南部，近年来广东、广西及福建亦有引种。降香黄檀不仅具有很高的木材价值，还具有广泛的药用价值。在海南民间，降香黄檀的树干和根部的干燥心材及种子普遍用于镇痛、止血、杀菌、活络和降压等方面。降香，为降香黄檀树干和根的干燥心材，性温味辛，可入药。《中国药典》(2005版) 中记载其具有行气止痛、活血止血的功效；用于心悸胸闷、肝郁胁痛、脘腹疼痛和胸痹刺痛等，外用跌扑损伤，外伤出血等。降香作为多种中药制剂的主要成分，常与其他活血化瘀药配伍用于心血管疾病的治疗，如冠心二号煎剂，香丹注射剂等。现代药理学的研究表明，其成分具有抗炎、抗凝血、血管舒张、抗高血脂、抑制白细胞三烯生物合成、中枢神经系统抑制以及抗肿瘤等作用。这说明降香黄檀具有进一步研究和开发利用的价值。降香黄檀易成活，但是生长速度慢，成材周期长，从种植到有可用心材出现需要多年时间(大约20年以上)，野生的降香黄檀数量稀少，近年来因用量急剧增大已遭到严重破坏，现为我国特有濒危药用植物。目前对降香黄檀的研究主要集中在心材。由于现有资源少，降香黄檀心材药用价值的开发利用受到一定局限。而其种子产量多，来源稳定，其药用价值的研究尚属空白。本发明开发了对降香黄檀籽的提取物和药效的研究。如果能够很好地开发利用降香黄檀籽这一资源，将对拓宽降香黄檀的应用范围大有裨益。
发明内容
本发明目的是制备降香黄檀籽提取物并且采用体外模型快速筛选抗凝血或抗血栓效果较好的提取物，为降香黄檀籽生物活性研究以及进一步开发利用奠定基础。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
降香黄檀籽提取物，其为降香黄檀籽的水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物。所述的降香黄檀籽水或有机溶剂提取物的具体制备过程为
1)将降香黄檀籽去果荚，中药粉碎机粉碎后过M目筛，以降香黄檀籽粗粉以mL/g计 10倍量的水或有机溶剂(体积分数在30%-95%的乙醇、正丁醇或乙酸乙酯)回流提取两次， 水浴温度为75°C，每次回流提取时间为1. 5-2小时。提取液4000r/min离心20min，收集上清液。2)将上清液旋转蒸发至干，用少量0. 05mol/mL pH7. 2的Tris-HCl缓冲液复溶，经过抽滤和硅藻土过滤，得到澄清的提取物浓溶液。3)将提取物浓溶液分别定容，取一定量置于玻璃称量瓶中烘箱烘干，测定各提取液中干物质的含量，平行测定三次，取平均值即为提取物母液浓度。4 )标定浓度后的提取物母液，分别稀释相应倍数，配制成1. 0-12. Omg/mL的降香黄檀籽提取物溶液。降香黄檀籽抗凝提取物筛选模型，建立筛选模型使用酶标仪测定降香黄檀籽提取物溶液的吸光度，吸光度与纤维蛋白的生成量成正比，通过吸光度的差值计算降香黄檀籽提取物溶液的抑制率，比较不同溶剂的提取物的抑制效果；模型建立的过程如下
1)测定波长的确定
以质量浓度0. 1%的纤维蛋白原为底物，分别加入2-12U/mL凝血酶，37°C保温lOmin，用酶标仪在波长390-600nm范围内进行扫描，记录吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。2)底物浓度的确定
固定酶的浓度为2U/mL，在96孔板小孔中分别加入浓度为0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. O、 2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. Omg/mL的纤维蛋白原，37°C下用酶标仪测定O-IOmin内的吸光度，以吸光度对时间作图，求出各自的反应初始速率V，重复三次，计算平均值。以底物浓度[S]为横坐标，[S]/V为纵坐标作出酶的Hanes-woolf图，求出米氏常数之值。根据夂选择适合的纤维蛋白原浓度。3)酶浓度和反应时间的确定
配制8. 00,6. 00,4. 00,2. 00、1. 00,0. 50,0. 25U/mL酶溶液。根据纤维蛋白原标准曲线， 选择8mg/mL的纤维蛋白原作为反应底物，根据上述操作步骤，用酶标仪测定405nm处不同浓度的酶在0-30min内的吸光度，以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标，做出酶反应程度随时间变化的曲线。根据曲线特点，并控制吸光值在0. SAbs以下，选择适合的酶浓度和反应时间。4)受试样品浓度范围确定
浓度分别为l、2、4、6、8、10、iaiig/mL的提取物溶液作为测试样。按照上述操作步骤，测定不同浓度样品对纤维蛋白生成的抑制率，以抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标做曲线。 选择抑制率与浓度呈线性的样品浓度范围。所述的降香黄檀籽提取物的抗凝活性筛选的方法，建立筛选模型
1)测定波长的确定酶标仪测定波长为405nm；
2)底物浓度的确定选择8mg/mL的纤维蛋白原作为反应底物；
3)酶浓度和反应时间的确定选择2U/mL凝血酶溶液，反应时间15min；
4)受试样品浓度范围确定降香黄檀籽提取物浓度l-8mg/mL。所述筛选模型筛选出用50%乙醇提取的降香黄檀籽提取物抗凝效果最佳，8mg/mL 浓度的抑制率达64. 72%。5)模型的方法评价 a.精密度
分别配制不同浓度的提取物溶液作为测试样品，测定纤维蛋白生成抑制率。各浓度样品分别重复测定10次，通过平均值、标准偏差(5 )和变异系数(CT)考察批内重复性。b.分析灵敏度
根据精密度实验(n=10)，将抑制剂浓度作为横坐标，反应前后吸光度差值的平均值作为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。同时测定10个样品空白的吸光度差值，求出 χ-2SD值，代入回归方程，求出分析灵敏度。c. Z因子理论验证有效性
具体过程通过对波长、底物浓度，酶浓度，反应时间等的考察建立了较为规范的筛选模型，在该模型下，测定 0. 0002mg/mL, 0. 001 mg/mL, 0. 005mg/mL, 0. 025mg/mL 的阳性药物肝素钠对凝血酶的抑制效果，重复三次，每组取平均值，以肝素钠的浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，做出阳性对照的抑制活性曲线，检验筛选模型的有效性。本发明具有如下优点
(1) 96孔酶标板最多可同时测定96个样本的数据，大大节省了工作时间。( 2)微量法测定节省实验材料和试剂的用量。( 3)同时操作，实验的重复性和重现性高。( 4)用酶标仪自动读取吸光度值，减少了人为读数的误差。
图1纤维蛋白扫描曲线，注曲线B"G加入的凝血酶浓度依次为2、4、6、8、10、12U/mL。图 2 Hanes-Woo If■作图
图3不同浓度的凝血酶动力学曲线图4抑制剂浓度对凝血酶活性抑制率的影响图5抑制剂浓度和吸光度差值曲线图6阳性对照药物浓度对凝血酶活性抑制率的影响。
具体实施例方式本发明结合附图和实例进一步地说明 实施例1 降香黄檀籽提取物的制备
将降香黄檀籽去果荚，中药粉碎机粉碎后过M目筛，取降香黄檀籽粗粉40g，分别用 400mL水、30%、50%、70%、85%、95%的乙醇、正丁醇或乙酸乙酯作为溶剂，回流提取两次，水浴温度为75°C，每次回流提取时间为1. 5-2小时。提取液4000r/min离心20min，收集上清液。将上清液旋转蒸发至干，用少量0. 05mol/mL pH7. 2的Tris-HCl缓冲液复溶，经过抽滤和硅藻土过滤，得到澄清的提取物浓溶液。将提取物浓溶液分别定容，取一定量置于玻璃称量瓶中烘箱烘干，测定各提取液中干物质的含量，平行测定三次，取平均值即为提取物母液浓度。标定浓度后的提取物母液，分别稀释相应倍数，配制成1. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0、 10.0,12. Omg/mL 的待测液。实施例2 筛选模型建立 (1)溶液配制
凝血酶1.6mg凝血酶(59U/mg)冻干粉溶于4mL Tris-HCl缓冲溶液中(轻轻颠倒，溶解)，得到MU/mL凝血酶母液，置于-20°C冰箱冷冻保存。使用时根据需要依次进行稀释。纤维蛋白原0. 08g纤维蛋白原冻干粉，于37°C水浴条件下溶于IOmL生理盐水，配成8mg/mL纤维蛋白原溶液，依次稀释成从高到低不同浓度的溶液。肝素钠以生理盐水配制肝素钠溶液，浓度分别为0.0002、0.0010、0.0050、 0. 0250mg/mL。降香黄檀籽提取物样品溶液降香黄檀籽提取物ET50，以生理盐水配制成浓度分别为 1. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. O、10. O、12. Omg/mL 的待测液。(2)操作方法
a.在96孔细胞培养板小孔中加入140 μ L纤维蛋白原溶液，40 μ L样品溶液，混勻，读数(似)。b.再加入20 μ L凝血酶溶液，开始反应，37°C保温一定时间后读数Us)。c.取40 μ L Tris-Hcl缓冲液代替样品液，其它同上，测得吸光值Uch Ac)。d.使用肝素钠作为阳性对照。e.依照下列公式计算各样品溶液抑制率
抑制率=
Ac 一 Aci
式中Jc——缓冲液替代样品的系统，加入凝血酶反应后的吸光度
Acb——缓冲液替代样品的系统的吸光度
As——加入样品溶液的系统，加入凝血酶反应后的吸光度
Asb——加入样品溶液的系统的吸光度
(3)模型建立
通过390-600nm波长扫描，在凝血酶浓度2_12U/mL的范围内，405nm处均有最大吸收峰。因此，根据最大吸收，确定测定波长为405nm。图1为纤维蛋白扫描曲线，注曲线B-G加入的凝血酶浓度依次为2、4、6、8、10、12U/mL。根据米氏方程，当底物浓度([S])远远小于米氏常数Gfm)时，反应符合一级动力学，此时酶没有全部被底物饱和，不能正确测得酶活；当[S]远大于^时，反应已达到最大速率，符合零级动力学，只有在此条件下才能正确测得酶活。图2是酶浓度固定为条件下，底物浓度范围从0. l-7mg/mL时所作的 Hanes-Woolf图，由回归方程为y=489. 87x+394. 52可以计算出Λ；值为0. 8mg/mL。—般认为酶测定时底物浓度最好为^的20倍乃至100倍。在实际工作考虑到底物溶解度的限制，价格的昂贵，可将底物浓度降为之的10倍左右。因此在本实验中，为保证反应体系中底物过量，且从纤维蛋白原的溶解度考虑，选择8mg/mL作为底物浓度，以准确地测定抑制剂的抑制能力。根据底物浓度的选择，我们把纤维蛋白原浓度固定为8mg/mL，然后记录了不同的酶浓度下反应的进程。图3所示的曲线表现的是不同凝血酶浓度及反应时间对反应速率的影响。图3是不同浓度的凝血酶动力学曲线，由图3可见，酶浓度为lU/mL，反应速率过慢，不便于测定酶活；酶浓度为6-8U/mL时，反应初期速率过快，反应在400s内趋于完全，也不便于测量；酶浓度为2U/mL和4U/mL时，IOmin内反应程度与时间呈较好的线性关系，且初期反应速率适中，较易测量，而相比4U/mL的酶，2U/mL反应吸光度不超过1. 0儿使测量更加精确，因此选择2U/mL作为反应的酶浓度。由图3还可以看出，400 s之后，2U/mL的酶反应速率逐渐变慢，900s左右反应程度趋近于完全，因此反应时间可选择7min到15min之间。 本实验选择的测定时间为15min。图4是浓度为1-lOmg/mL的受试样品抑制率曲线，由图可见，ET50浓度在8mg/mL 以下时，浓度与抑制率呈较好的线性关系，回归方程为y=28. 934x+20. 131 (R2=O. 9529).因此，确定受试样品的浓度范围为l-8mg/mL。3.模型评价
1)精密度(批内重复性)
模型采用批内重复性实验进行考察。批内精密度是同一次测定的精密度，通常采用不同浓度的同一样品7-10份，每种浓度样品按照既定方法操作，一次开机后一一测定。计算每种浓度样品的标准差(5 )或相对标准差(MSD),也称为变异系数(67)。所得CT应争取达到5%以内，但不能超过10%。根据样品浓度的线性范围，选择浓度为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL的ET50溶液，测定凝血酶活性抑制率。表1所示，10次平行，各浓度提取物溶液的抑制率变异系数均 <10%，因此批内重复性达到标准，模型具有可靠性。抑制剂浓度为6mg/mL时，标准差和变异系数均为最小值，分别是士 1. 09和3. 35%。表1精密度(批内重复性)实验(Ii=IO)
权利要求
1.降香黄檀籽提取物，其为降香黄檀籽的水、乙醇、正丁醇、或乙酸乙酯提取物。
2.根据权利要求1所述的降香黄檀籽提取物的制备方法，其特征在于制备过程为1)将降香黄檀籽去果荚，中药粉碎机粉碎后过M目筛，以降香黄檀籽粗粉以mL/g计 10倍量的水或有机溶剂回流提取两次，水浴温度为75°C，每次回流提取时间为1. 5-2小时， 提取液4000r/min离心20min，收集上清液；所述回流提取的有机溶剂为体积分数在30%-95%的乙醇、30%-95%的正丁醇或30%_95% 的乙酸乙酯；2)将上清液旋转蒸发至干，用少量0.05mol/mL pH 7. 2的Tris-HCl缓冲液复溶，经过抽滤和硅藻土过滤，得到澄清的提取物浓溶液；3)将提取物浓溶液分别定容，取一定量置于玻璃称量瓶中烘箱烘干，测定各提取液中干物质的含量，平行测定三次，取平均值即为提取物母液浓度；4)标定浓度后的提取物母液，用蒸馏水分别稀释相应倍数，配制成1.0-12. Omg/mL的降香黄檀籽提取物溶液。
3.权利要求1所述降香黄檀籽提取物的抗凝活性筛选的方法，其特征在于建立筛选模型使用酶标仪测定降香黄檀籽提取物溶液的吸光度，吸光度与纤维蛋白的生成量成正比， 通过吸光度的差值计算降香黄檀籽提取物溶液的抑制率，比较不同溶剂的提取物的抑制效果；模型建立的过程如下1)测定波长的确定以质量浓度0. 1%的纤维蛋白原为底物，分别加入2-12U/mL凝血酶，37°C保温lOmin，用酶标仪在波长390-600nm范围内进行扫描，记录吸光度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线；2)底物浓度的确定固定凝血酶的浓度为2U/mL，在96孔板小孔中分别加入浓度为0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、 0. 8,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. Omg/mL的底物纤维蛋白原，37 °C下用酶标仪测定 O-IOmin内的吸光度，以吸光度对时间作图，求出各自的反应初始速率V，重复三次，计算平均值，以底物浓度[S]为横坐标，[S]/V为纵坐标作出酶的Hanes-woolf图，求出米氏常数 &值，根据之选择适合的纤维蛋白原浓度；3)酶浓度和反应时间的确定配制8. 00,6. 00,4. 00,2. 00、1. 00,0. 50,0. 25U/mL凝血酶溶液，根据纤维蛋白原标准曲线，选择8mg/mL的纤维蛋白原作为反应底物，根据上述操作步骤，用酶标仪测定405nm处不同浓度的凝血酶在0-30min内的吸光度，以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标，做出酶反应程度随时间变化的曲线，根据曲线特点，并控制吸光值在0. SAbs以下，选择适合的凝血酶浓度和反应时间；4)受试样品浓度范围确定浓度分别为l、2、4、6、8、10、iaiig/mL的提取物溶液作为测试样，按照上述操作步骤，测定不同浓度样品对纤维蛋白生成的抑制率，以抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标做曲线， 选择抑制率与浓度呈线性的样品浓度范围；5)模型的方法评价批内重复性良好，变异系数CV<10，Z因子检验模型有效。
4.根据权利要求3所述的降香黄檀籽提取物的抗凝活性筛选的方法，其特征在于建立筛选模型1)测定波长的确定酶标仪测定波长为405nm；2)底物浓度的确定选择8mg/mL的纤维蛋白原作为反应底物；3)酶浓度和反应时间的确定选择2U/mL凝血酶溶液，反应时间15min；4)受试样品浓度范围确定降香黄檀籽提取物浓度l-8mg/mL。
5.根据权利要求1所述的降香黄檀籽提取物，其特征在于使用所述筛选模型筛选出用 50%乙醇提取的降香黄檀籽提取物抗凝效果最佳，8mg/mL浓度的抑制率达64. 72%。
全文摘要
降香黄檀籽提取物制备及其抗凝活性快速筛选的方法，属于保健食品、生物和医药领域。本发明涉及降香黄檀籽提取物的制备方法以及利用纤维蛋白原和凝血酶模型，建立一种体外快速筛选降香黄檀籽抗凝提取物的方法，该筛选方法的特征是操作简便，快捷高效，重复性良好，可用于高通量筛选，可以评价植物天然粗提物的抗血栓、抗凝血药效，以便进行初步筛选，还可以用于抗血栓体外效果的检验。
文档编号A23L1/29GK102204949SQ201110117679
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者李晓瑄, 王莉, 郑联合, 郭璇, 陈正行 申请人:江南大学