专利名称：一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法
技术领域：
本发明涉及转基因技术领域，具体地说是一种快速检测外源基因表达及外源基因对羊毛作用的方法。
背景技术：
目前，对大动物验证外源基因产生的影响一般采用小鼠模型，但由于物种间对外源基因所起的作用存在很大的差异，所以很难真实体现外源基因对目标动物的实际影响。 另外，未在动物个体水平上做功能验证之前，开展转基因动物生产具有一定的盲目性和表型的不确定性。以改善羊毛生长和品质进行转基因绵羊的研究，在开展转基因绵羊的生产前就非常有必要确定外源基因是否正确表达、外源基因对羊毛生长以及毛囊发育的作用， 从而克服生产转基因绵羊的盲目性。家畜转基因动物制作的生产成本高，繁殖周期长，设计技术环节繁琐等给转基因绵羊的制作带来巨大的障碍。因而要想通过转基因动物的方式检测外源基因对羊毛生长和毛囊发育的作用，具有时间长，耗资大、操作受限等诸多不利因素。即使在获得转基因个体的情况下，由于转基因个体间受环境、饲料等诸多因素的影响， 造成个体基础数据之间的变异较大，依然不能准确体现外源基因对羊毛的作用(对羊毛生长的作用和毛囊发育的作用)。有鉴于上述现有的用小鼠模型做实验或用转基因动物进行检测外源基因表达及其对羊毛作用的技术存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法，能够改进一般现有技术存在的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法。本发明方法检测周期短，能准确体现外源基因是否在皮肤毛囊中正确表达和外源基因对羊毛的作用。为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法，将外源基因用活体转染试剂包裹注射到绵羊真皮层作为实验区，在该绵羊的不同部位注射稀释外源基因的溶质作为对照区，通过实验区和对照区的对比检测外源基因表达及其对羊毛作用。进一步，所述外源基因和溶质通过无针注射器注射。进一步，所述外源基因和溶质的注射方式为将注射部位的皮肤对折进行注射。进一步，所述外源基因和溶质的注射深度为3 5毫米。进一步，所述实验区和对照区位于绵羊背部对称的两侧。进一步，所述外源基因以pDsRed2-l为载体骨架，从pIRES_EGFP质粒上获得 CMV启动子，插入到pDsRed2-l多克隆位点中，驱动红色荧光蛋白基因的表达；然后根据 GenBank中的序列设计引物，并引入酶切位点，从绵羊基因组中克隆得到IGFI、KAP6. 1基因的序列，然后构建在KAP6. 1启动子驱动下表达IGFI的真核表达载体。与现有技术相比，本发明的有益效果在于本发明快速检测外源基因对羊毛作用的方法能在同一个体、同一时间、同一代谢水平上检测外源基因对羊毛的作用。具体的检测内容及检测方法根据需要均可在现有技术中找到。一般包括羊毛的生长速度、密度、品质及毛囊发育(静止期毛囊与生长期毛囊相互转化)的作用，以及基因表达等。因为只有在外源基因正确表达的前提下才对羊毛有作用， 各项检测才有意义，增强了转基因绵羊生产的目的性。避免了不同个体间的差异，缩短了功能验证的周期。即使在获得转基因个体的情况下，由于转基因个体间受环境、饲料等诸多因素的影响，造成个体基础数据之间的变异较大。在保证检测质量的前提下大大降低了难度， 减少了成本。
图1为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法的对照区和实验区的选取部位图片；图2为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法的对照区的放大图片；图3为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法的在对照区和实验区进行注射的图片；图4为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法的在对照区和实验区进行皮肤截取的图片；图5为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法中用多聚甲醛固定后组织块的图片；图6为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法中注射后的对照区在显微镜下毛囊观察的图片；图7为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法中注射后的实验区在显微镜下毛囊观察的图片；图8为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法中的对照区基因表达检测的图片；图9为本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法中的实验区基因表达检测的图片。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法，将外源基因用活体转染试剂包裹，并通过无针注射器注射到绵羊真皮层作为实验区；用无针注射器在该绵羊的不同部位注射稀释外源基因的溶质作为对照区。从而可以直接观测对羊毛生长的作用，或者截取转染部位皮肤的方法，分析外源基因对毛囊发育的作用。本发明的技术方案与现有技术的区别主要在于，本发明的快速检测外源基因对羊毛作用的方法是在相同时期，以同一个体的不同部位作为实验区及对照区，避免了以不同物种作为实验对象的物种之间差异的问题，及以转基因动物为实验对象周期长及转基因个体间受环境、饲料等诸多因素的影响，造成个体基础数据之间的变异较大的问题。首先用小鼠做试验并不能完全代表外源基因对羊毛的生长作用。其次在所有条件具备的情况下，涉及的操作难度较大、技术性要求也高，采用原核注射或干细胞的方法制作转基因小鼠(但制作过程并不一定每次都能成功)，前期准备工作(干细胞培养和转基因、或者原核期胚胎准备)，这个时间是难以确定的，至少在母体中怀孕要经过20天左右才可能获得材料用于检测。转基因羊需要的时间就更长，羊的妊娠期至少是150天，况且制作转基因羊的难度是相当大的，成功率也非常低。可见用转基因羊对外源基因进行相关检测的成本非常高。本方法的发明可用于在制作转基因羊之前，验证对羊毛的作用、构建载体是否正确以及外源基因是否能表达等相关的检测。解决制作与羊毛相关转基因羊的盲目性。采用本发明的方法可以简便地检测外源基因是否对羊毛有作用、有何种作用，以及用于检测外源基因是否能在皮肤中定位表达。这样可以根据检测结果来判断是否用该外源基因和构建的载体来做转基因动物。在本发明的方法中，外源基因的构建、转染试剂的选用以及检测的内容和方法等均可从现有技术中获得。下面对几种常规的检测内容进行示例性说明。基因的表达检测注射2天后便可进行检测。毛囊的发育情况注射后10-15天便可进行检测。羊毛生长情况需较长时间45天左右，便可进行检测，毛长的越长分析起来越方便。羊毛生长速度就是在一定时间内直接截取羊毛检测长度而确定生长速度。羊毛密度在相同大小区域内，检测羊毛的根数。羊毛品质观测羊毛的弯曲和细度。检测毛囊发育情况将固定后的的组织用石蜡包埋后，石蜡切片机切片，经H. E染色，观察毛囊的发育情况。毛囊发育情况主要观测毛囊是处于静止期(毛乳头变尖，瘦小)， 还是生长期(毛乳头呈扁平状)。目的基因检测的方法切片后，采用免疫组织化学的方法检测目的基因的表达。这是一种常规的方法，用于检测某一蛋白在组织中的表达情况。下面仅以其中一种优选对本发明做详尽的说明。本实施例的绵羊品种选用中国美利奴羊。以胰岛素样生长因子-IGFI (KAP6. 1 GenBank M95719, IGF-I GenBank ΝΜ_001009774)说明外源基因的构建如下以 pDsRed2_l 为载体骨架，从PIRES2-EGFP质粒上获得CMV启动子，插入到pDsRed2-l多克隆位点中，驱动红色荧光蛋白基因的表达；然后根据GenBank中的序列设计引物，并引入酶切位点，从绵羊基因组中克隆得到IGFI、KAP6. 1基因的序列。然后构建在KAP6. 1启动子驱动下表达IGFI 的真核表达载体。活体转染试剂选用invitrogen Lipofectamine LTX & Plus。如图1和图2所示，所选背部对称的两侧作为实验区2和对照区1进行注射。如图3所示，将皮肤对折采用无针注射器进行注射，注射到真皮层的深度为3-5毫米左右。具体的检测内容包括以免疫组织化学的方法观测目的基因(IGFI)表达情况，采用IGFI抗体显示IGFI在毛囊中的表达情况(颜色越深，表达量越高)，如图8和图9所示，实验组(图9)中IGFI表达量明显高于对照组(图8)，表明目的基因能够正常表达。如图 6和图7所示的H.E染色结果图，观测毛囊发育情况，实验组(图7)的毛乳头与对照组(图 6)相比，处于生长期，而对照组毛乳头较尖，处于静止期或生长后期。采集毛样测量羊毛长度、细度、强度等指标，从而综合评价目的基因对羊毛的作用。检测所需的组织的切取参考图4。如图4所示，截取转染部皮肤是在注射部位用手术刀片直接截取0. 5厘米2左右的皮肤(图中画线的区域)。图5为多聚甲醛对截取的皮肤固定后的组织块图片。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法，其特征在于，将外源基因用活体转染试剂包裹注射到绵羊真皮层作为实验区，在该绵羊的不同部位注射稀释外源基因的溶质作为对照区，通过实验区和对照区的对比检测外源基因表达及其对羊毛作用。
2.根据权利要求1所述的快速检测外源基因对羊毛作用的方法，其特征在于，所述外源基因和溶质通过无针注射器注射。
3.根据权利要求1所述的快速检测外源基因对羊毛作用的方法，其特征在于，所述外源基因和溶质的注射方式为将注射部位的皮肤对折进行注射。
4.根据权利要求1所述的快速检测外源基因对羊毛作用的方法，其特征在于，所述外源基因和溶质的注射深度为3 5毫米。
5.根据权利要求1所述的快速检测外源基因对羊毛作用的方法，其特征在于，所述实验区和对照区位于绵羊背部对称的两侧。
6.根据权利要求1所述的快速检测外源基因对羊毛作用的方法，其特征在于，所述外源基因以pDsRed2-l为载体骨架，从pIRES_EGFP质粒上获得CMV启动子，插入到pDsRed2-l 多克隆位点中，驱动红色荧光蛋白基因的表达；然后根据GenBank中的序列设计引物，并引入酶切位点，从绵羊基因组中克隆得到IGFI、KAP6. 1基因的序列，然后构建在KAP6. 1启动子驱动下表达IGFI的真核表达载体。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测外源基因对羊毛作用的方法，将外源基因用活体转染试剂包裹注射到绵羊真皮层作为实验区，在该绵羊的不同部位注射稀释外源基因的溶质作为对照区，通过实验区和对照区的对比检测外源基因表达及其对羊毛作用。本发明方法具有检测周期短，准确性高的特点。
文档编号C12Q1/68GK102181561SQ20111011784
公开日2011年9月14日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者代蓉, 刘守仁, 周平, 唐红, 王新华, 王立民 申请人:新疆农垦科学院