专利名称：对干扰素治疗肾细胞癌反应的鉴定标记的制作方法
技术领域：
本申请是2003年4月8日提交的申请号为03807838. 4，发明名称为“具有改进形态发生的植物及其制备方法”申请的分案申请。本发明涉及利用人基因多态性作为指示物 (标记)，评估使用干扰素对肾细胞癌的肿瘤抑制效果的方法，在这种方法中使用的寡核苷酸，以及这种基因多态性的检测试剂盒。
背景技术：
肾细胞癌是对目前实施的任何治疗，例如，使用化学治疗药物、免疫治疗药物等的药物治疗、放射治疗、外科手术和/或类似方法的反应率都较低的难治性疾病。此外，据报道，到诊断出患有肾细胞癌时已经发展为远程转移的病例高达大约30%。除外科手术外， 上述药物治疗中使用干扰素(IFNs)的免疫治疗被认为特别有效；但是，单独施用IFN-a 时，通过这种治疗获得的反应率低到只有大约15%，单独施用IFN-Y时，反应率只达到 10-15%。即使与抗癌剂组合使用，也没有获得产生的效果比IFN-α单一疗法更高的其他治疗方法。目前实施的使用IFN的免疫疗法主要是单独使用IFN-α或联合使用IFN-γ的长期维持治疗。与此同时，基因组科学的发展正在快速阐明与药物反应性有关的药物动力学、酶和蛋白质的基因多态性等等。在人基因组分析中，因为最经常发现基因多态性标记，因此单核苷酸多态性(SNPs)已经引起大家注意。已知这种SWs可用于分析与常见疾病、药物反应等等相关的人基因组(参见非专利文件1、2和3)。也已经已知利用多种SNPs的单倍体分析可用于分析对疾病的易感性(参见非专利文献4)。近来，为了建立所谓的个体病人定制医学，已经提议研究揭示给定的基因多态性和病人的药物敏感性/药物反应性之间的关系。预测IFN治疗效果的已知方法是分析HCV(人丙型肝炎病毒(人HCV))感染病人的基因组上的MxA-8/MxA123 MBL-221/MBL-CLD密码子MSNPs与IFN-α应答者(对该治疗反应性的病人)和非应答者(对该治疗没反应性的病人)之间的关系，从而预测和评估 HCV感染的病人对IFN治疗的反应程度(专利文献1)。另一个已知方法利用IFN-α受体 2基因的启动子区域和位置134处的SNP作为基因多态性标记来预测IFN治疗反应(专利文献2)。该文件公开的靶疾病从由乙型肝炎、丙型肝炎、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、皮肤恶性黑色素瘤，类肝炎、肾癌、多发性骨髓瘤、毛细胞白血病、慢性髓细胞性性白血病、亚急性硬化性全脑炎、病毒性脑炎、免疫抑制病人的全身性带状疱疹和水痘、未分化鼻咽癌、伴随听力减退的内耳病毒感染性疾病、疱疹性角膜炎、扁平湿疣、尖锐湿疣、由腺病毒和/或疱疹病毒感染引起的结膜炎、生殖器疱疹、感冒疮、子宫颈癌、癌性胸膜积水、角化棘皮瘤、基底细胞癌和δ型慢性活动型肝炎。此外，评估IFN-α治疗丙型肝炎的反应的已知方法是测量IRF-1基因启动子区域位置196处的鸟嘌呤(G)被置换成腺嘌呤(A)(参见专利文献3)。但是迄今为止，还没有文件具体报告IFN对肾细胞癌的治疗反应与给定SNPs之间的关系。已经报道IFN-α应答者和非应答者的几百个基因表达图谱(参见非专利文献4 和专利文献4)。这些图谱是利用如DNA芯片(高密度寡核苷酸或微阵列)、差异显示、差异 cDNA阵列、SAGE(基因表达系列分析)、表达序列标签数据库比较等技术产生的。这些方法可用来分析结肠癌、乳癌、卵巢癌、多发性硬化病变、白血病和肾细胞癌中的基因表达。此外非专利文献4还包括了如IRF2、STAT1、STAT2、STAT4、STAT5、STAT6等的基因；但是，没有公开用于本发明的具体基因的SNPs。[专利文献1]未审查的日本专利出版物No.2003-88382[专利文献2]未审查的日本专利出版物No.2003-339380[专利文献3]未审查的日本专利出版物No.2001-136973[专利文献4]未审查的日本专利出版物No.2004-507253[非专利文献 1]Brookes，A. J.，“ The essence of SNPs" , Gene, USA, (1999), 234，177-186[非专利文献 2]Cargill，M，等，“Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes" , Nature Genet. , USA, (1999),22, 231-238[3]Evans, W. E. ，&Relling，M. V. ，‘‘ Pharmacogenomics translating functional genomics into rational therapeutics " , Science, USA, (1999),286, 487-491[非专利文献 4]Schlaak，J. F.，et. al.，“ Cell-type and Donor-specific Transcriptional Responses to Interferon-α " , J. Biol. Chem. , (2002)277,51, 49428-49437发明公开的内容发明解决的问题本发明的主要目标是提供评估使用干扰素对肾细胞癌的治疗反应(肿瘤抑制效果)的方法。解决问题的方法为了解决上述问题，本发明的发明人任意挑选了 33个基因作为基因多态性分析的候选基因，这些基因包括IFN相关基因、据报道与IFN-Y信号转导有关的基因，以及据报道添加/施用IFN时其表达发生改变的基因。发明人利用公共的多态性数据库搜索了这些候选基因上的SNPs，最终选择出了 463个候选SNPs。然后，利用来源于两个病人组施用 IFN-α在肾细胞癌诱导出肿瘤抑制效果的IFN应答者组(对该治疗起反应的病人)和IFN 非应答者组(对该治疗不起反应的病人)的基因组DNA样品，确定选择的这些SNPs的频率差异。结果，发明人发现下列8个基因上SNPs在上述两个组之间存在统计学上有意义的差已升。(1)STAT3基因(转录的信号转导物和激活因子3 :STAT3 (GenBank登记入册号 NT_010755))(以下简称〃 STAT3 基因〃)、(2)SSI3基因(细胞因子信号抑制剂3 :SSI3 (GenBank登记入册号NT_010641)) (以下简称"SSI3基因")、
(3)IL_4R基因(白细胞介素4受体(GenBank登记入册号NT_010393))(以下简称〃 IL-4R")、G)IRF2基因(干扰素调节因子2 :IRF2(GenBank登记入册号NT_022792))(以下简称〃 IRF2基因〃)、(5) ICSBP基因(干扰素共有序列结合蛋白ICSBPl (GenBank登记入册号 ΝΤ_019609)(以下简称"ICSBPl 基因〃)、(6) PTGSl基因(前列腺素内过氧化物合酶1 :PTGS1 (GenBank登记入册号 NT_008470)(以下简称"PTGSl 基因〃)、(7) PTGS2基因(前列腺素内过氧化物合酶2 :PTGS2 (GenBank登记入册号 NT_004487)(以下简称〃 PTGS2 基因〃)、(8) TAP2基因(转运蛋白，ATP结合盒，主要组织相容性复合物2 :TAP2 (GenBank登记入册号NT_007592)(以下简称〃 TAP2基因")本发明的发明人更进一步地研究了上述基因上存在的SNPs与IFN治疗肾细胞癌的反应之间的关系。结果，发明人已经证实16个SM^s与施用IFN-α对肾细胞癌的肿瘤抑制效果密切相关，而且发明人也意识到这些SWs可以作为评估IFN治疗后的肿瘤抑制效果的标记。更具体地说，发明人已经发现检测这些SWs能够预测施用的IFN对肾细胞癌的肿瘤抑制效果(治疗反应)(预测性诊断)。发明人以这些发现为基础，通过更进一步的研究完成了本发明。本发明提供了如下文1-11条所描述的评估对肾细胞癌病人进行IFN治疗后的肿瘤抑制效果的方法。条款1. 一种评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，该方法包括下列步骤⑴到(iv)；(i)获取来源于肾细胞癌病人的基因样品(基因组DNA样品)的步骤、(ii)利用在上述步骤(i)中获得的基因样品，制备选自STAT3基因、SSI3基因、 IL-4R基因、IRF2基因、ICSBP基因、PTGSl基因、PTGS2基因和TAP2基因中的至少一个基因的基因组DNA或其互补链的步骤、(iii)分析基因组DNA或其互补链的DNA序列，并确定其基因多态性、和(iv)利用上述步骤(iii)中确定的至少一个基因多态性作为标记，评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果。条款2. —种依照条款1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法， 其中基因多态性是选自STAT3基因、IL-4R基因、IRF2基因和TAP2基因中的至少一个基因的多态性。条款3. —种依照条款1的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法， 其中基因多态性是选自下列(a)到(P)的至少一种多态性(a)在STAT3基因的位置4M3095处具有基因型C/T或T/T的基因多态性 (STAT3-2)，用参考的 SNP ID 编号rsl905341 表示、(b)在STAT3基因的位置4264拟6处具有基因型C/C的基因多态性(STAT3-3)，用参考的SNP ID编号rs4796793表示、(c)在STAT3基因的位置4204027处具有基因型G/G的基因多态性(STAT3-17)，用参考的SNP ID编号rs2^3152表示、(d)在STAT3 (KCNH4)基因的位置4050541处具有基因型C/T的基因多态性 (STAT3-18)，用参考的 SNP ID 编号:rs2293153 表示、(e)在SSI3基因的位置10M6541处具有基因型A/C的基因多态性(SSI3-1)，用参考的SNP ID编号:rs2280148表示、(f)在IL-4R基因的位置18686025处具有基因型A/A的基因多态性(IL-4R-22)， 用参考的SNP ID编号rsl805011表示、(g)在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A的基因多态性(IRF2-67)，用参考的SNP ID编号rs2797507表示、(h)在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C的基因多态性(IRF2-82)，用参考的SNP ID编号:rs796988表示、(i)在ICSBP基因的位置390141处具有基因型A/A或A/C的基因多态性 (ICSBP-38)，用参考的 SNP ID 编号:rs2292982 表示、(j)在PTGSl基因的位置沈793813处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-3)， 用参考的SNP ID编号rsl213264表示、(k)在PTGSl基因的位置沈794182处具有基因型C/T的基因多态性(PTGS1-4)， 用参考的SNP ID编号rsl213265表示、(1)在PTGSl基因的位置沈794619处具有基因型A/G的基因多态性(PTGS1-5)， 用参考的SNP ID编号rsl213266表示、(m)在PTGS2基因的位置156973 处具有基因型G/G的基因多态性(PTGS2-12)， 用参考的SNP ID编号:rs2745557表示、(η)在ΤΑΡ2基因的位置23602539处具有基因型G/G的基因多态性(ΤΑΡ2-5)，用参考的SNP ID编号:rs2071466表示、(ο)在IL-4R基因的位置18686068处具有基因型C/C的基因多态性(IL-4R-14)， 用参考的SNP ID编号rs2234898表示、(ρ)在IL-4R基因的位置18686553处具有基因型T/T的基因多态性(IL_4Rj9)， 用参考的SNP ID编号rsl801275表示。条款4. 一种依照条款3的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法， 其中基因多态性是条款3的(a)、(f)、(h)、(η)、(ο)和(ρ)中的任何一种。条款5. —种依照条款1-4中任何一项的评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制效果的方法，其中IFN选自IFN- α、重组IFN- α和重组IFN- γ。条款6. —种依照条款1-5中任何一项的方法，其中基因多态性是通过选自直接测序、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)-斑点印迹分析、单核苷酸引物延伸法、PCR单链构象多态性(SSCP)分析、PCR限制性片断长度多态性(RFLP)分析、侵入方法、定量实时PCR和使用质谱仪的质谱阵列中的至少一种方法确定的。条款7.依照条款6的方法，其中通过侵入方法或直接测序确定基因多态性。条款8.依照条款6的方法，其中通过PCR-RFLP分析确定基因多态性。条款9.依照条款8的方法，其中利用限制性内切酶Mspl，用PCR-RFLP分析检测人 STAT3基因内含子4204027处的G到C突变:rs2293152。
条款10.依照条款6的方法，其中利用选自下列(a)到(ρ)中的至少一种寡核苷酸作为基因多态性检测探针或引物确定基因多态性(a)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4243095具有基因型C/T或T/T的由参考SNP ID 编号rsl905341表示的基因多态性位点，(b)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4264拟6具有基因型C/C的由参考SNP ID编号 rs4796793表示的基因多态性位点，(c)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3基因的位置4204027具有基因型G/G的由参考SNP ID编号 rs2293152表示的基因多态性位点，(d)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在STAT3(KCNH4)基因的位置4050541具有基因型C/T的由参考SNP ID编号rs2^3153表示的基因多态性位点，(e)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在SSI3基因的位置10M6541具有基因型A/C的由参考SNP ID编号 rs2280148表示的基因多态性位点，(f)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686025具有基因型A/A的由参考SNP ID编号 rsl805011表示的基因多态性位点，(g)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17736877具有基因型A/A的由参考SNP ID编号 rs2797507表示的基因多态性位点，(h)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17744613具有基因型C/C的由参考SNP ID编号 rs796988表示的基因多态性位点，(i)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在ICSBP基因的位置390141具有基因型A/A或A/C的由参考SNP ID 编号表示的基因多态性位点，(j)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGSl基因的位置沈793813具有基因型C/T的由参考SNP ID编号 rsl213264表示的基因多态性位点，(k)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGSl基因的位置沈794182具有基因型C/T的由参考SNP ID编号 rsl213265表示的基因多态性位点，(1)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGSl基因的位置沈794619具有基因型A/G的由参考SNP ID编号 rsl213266表示的基因多态性位点，(m)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在PTGS2基因的位置156973 具有基因型G/G的由参考SNP ID编号 rs2745557表示的基因多态性位点，(η)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在ΤΑΡ2基因的位置23602539具有基因型G/G的由参考SNP ID编号 rs2071466表示的基因多态性位点，(ο)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686068具有基因型C/C的由参考SNP ID编号 rs2234898表示的基因多态性位点，和(ρ)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IL-4R基因的位置18686553具有基因型T/T的由参考SNP ID编号 rsl801275表示的基因多态性位点。条款11.依照条款6的方法，其中基因多态性检测引物对是下列(a)到(ρ)中的任何一个(a) E自SEQIDNos.1和17代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(b) E自SEQIDNos.2和18代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(c) E自SEQIDNos.3和19代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(d) E自SEQIDNos.4和20代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(e) E自SEQIDNos.5和21代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(f) E自SEQIDNos.6和22代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(g) E自SEQIDNos.7和23代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(h) E自SEQIDNos.8和M代表的序列组成的S核苷酸汚丨物对，
(i) E自SEQIDNos.9和25代表的序列组成的遽核苷酸汚丨物对，
(j) E自SEQIDNos.10和沈代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对，
(k) E自SEQIDNos.11和27代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对，
(1) E自SEQIDNos.12和观代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对，
(m) E自SEQIDNos.13和四代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对，
(η) E自SEQIDNos.14和30代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对，
(ο) E自SEQIDNos.15和31代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对，以及
(P) E自SEQIDNos.16和30代表的序列组成的;寡核苷5睃引物对。
发明的效果本发明提供了检测对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记的方法，特别是包括检测来自肾细胞癌病人标本的特定的人基因多态性或基因型和评估所述病人的IFN治疗反应 (肿瘤抑制效果)的方法，用于该方法的试剂盒、基因多态性、基因型和用于该方法和试剂盒的基因型检测探针和引物。他们在实施个体病人定制医学中可用于确定药物选择优先级。实施本发明的最佳方式在本说明书中使用的氨基酸、肽、碱基序列、核酸等等的缩写与IUPAC-IUB规贝Ij (IUPAC-1UB communication on Biological Nomenclature，Eur. J. Biochem.，138 9(1984))， (〃 Enki-hairetsu mataha aminosan—hairetsu wo fukumu meisaisho nadono sakusei no tameno gaidorain"(准备含有碱基序列或氨基酸序列的说明书的指南 Guidelines for preparation of specifications containing base sequences or amino acid sequences"(由日本专利局汇编)和相关领域使用的标准符号一致。本说明书中使用的"基因多态性"和"多态性"指占据一个位点的多种等位基因群或这种群中的个体等位基因。在这些多态性中，只有一个核苷酸不同的那些多态性被定义为单核苷酸多态性或SNP。单核苷酸多态性在本说明书中缩写为"SNP"。单倍体标明了上述基因多态性(SNPs)的种类，以在连续的基因区域或基因群组中的多个SNP位点中的等位基因的种类和数量为基础表示。在本说明书中，基因型指给定基因多态性位点中的基因位点的等位基因状况。例如，在STAT3基因的位置4243095处的SNP基因型(STAT3D表示为C/T杂合型或T/T纯合型。这也可以表示为〃 STAT3-2C/T或T/T"。当病人具有基因型STAT3-2C/T或T/T时， 预计病人可能对IFN治疗肾细胞癌(肿瘤抑制效果)作出响应(PR:部分响应)或作出很好的响应(CR 完全响应)。因此，基因型STAT3-2C/T或T/T可用作鉴定对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记。本说明书中标明的人基因的基因组序列与在核酸序列数据库NCBI (国家生物技术信息中心)(National Center for Biotechnology Information)登记的 GenBank 登录号(e.g. :NT_010641)下的核酸序列一致。同样，在NCBI的SNP数据库中的参考SNP ID编号(例如 rsl213265)(参见参考 SNP(refSNP)群报告，在 <http//www. ncbi. nlm. nih. gov/ SNP>中可找到)下也可以发现在本发明中被称为人基因多态性的SNPs的位点信息和核酸突变信息。也可以依照参考SNP ID编号标明本说明书中使用的SNP信息。表1显示从GenBank中获得的关于基因序列、mRNA序列、SNP位点和核酸突变的基本fe息。表 权利要求
1.一种基因多态性检测引物对，其是至少一种选自如下(e)，(g)和(h)的引物对(e)由SEQ ID Nos. 5和21代表的序列组成的寡核苷酸引物对，(g)由SEQID Nos. 7和23代表的序列组成的寡核苷酸引物对，以及(h)由SEQID Nos. 8和对代表的序列组成的寡核苷酸引物对。
2.寡核苷酸作为探针在制备用于评估IFN治疗对肾细胞癌病人的肿瘤抑制的检测试剂盒中的应用，其中寡核苷酸是至少一种选自如下(e)，(g)和(h)的寡核苷酸(e)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在SSI3基因的位置10M6541处具有基因型A/C，并由参考SNP ID编号 rs2280148 表示，(g)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A，并由参考SNP ID编号 rs2797507表示，以及(h)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C，并由参考SNP ID编号 rs796988 表示。
3.—种检测试剂盒，其包括选自如下(e)，(g)和(h)的至少一个引物对(e)由SEQ ID Nos. 5和21代表的序列组成的寡核苷酸引物对，(g)由SEQID Nos. 7和23代表的序列组成的寡核苷酸引物对，(h)由SEQID Nos. 8和对代表的序列组成的寡核苷酸引物对，标记试剂，以及实施PCR需要的试剂。
4.一种标记物，其是至少一种选自如下(e), (g)和(h)的标记物(e)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在SSI3基因的位置10M6541处具有基因型A/C，并由参考SNP ID编号 rs2280148 表示，(g)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17736877处具有基因型A/A，并由参考SNP ID编号 rs2797507表示，以及(h)具有由包含基因多态性位点的至少10个连续碱基组成的序列的寡核苷酸，其中基因多态性位点是在IRF2基因的位置17744613处具有基因型C/C，并由参考SNP ID编号 rs796988 表示。
全文摘要
本发明涉及对干扰素治疗肾细胞癌反应的鉴定标记。本发明提供了对IFN治疗肾细胞癌反应的鉴定标记，以及检测该标记的方法。即，该方法包括从肾细胞癌病人的标本中制备人基因的基因组DNA或其互补链，分析基因组DNA或其互补链的DNA序列以确定人基因的基因多态性，以及利用该多态性作为指示物评估IFN治疗对肾细胞癌的肿瘤抑制效果。
文档编号C12Q1/68GK102242196SQ20111012849
公开日2011年11月16日 申请日期2005年10月24日 优先权日2004年10月28日
发明者东间纮, 中村刚, 关丰和, 内藤诚二, 塚本泰司, 小川修, 平尾佳彦, 白土敬之, 野濑善明, 香川征 申请人:大塚制药株式会社