专利名称：一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺及其应用。
背景技术：
微生物胞外多糖是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。它与普通多糖相比，理化性质独特，结构和功能具优良特异性。目前对微生物胞外多糖生物活性的研究主要集中在医药、食品、化工领域，如抗肿瘤药物、增强免疫力的功能性食品、絮凝剂等化工产品；但对于胞外多糖在农业方面，尤其在肥料中的应用研究还较少。本发明旨在利用优良微生物菌株，通过优化培养基，改进生产工艺，降低产品成本，使其优良功能在肥料应用中得以发挥利用。
发明内容
针对全球变暖，水资源短缺，土壤沙化、重金属污染日益严重的现状及传统化学肥料和普通微生物肥料的不足，本发明旨在利用筛选到的一种冷解糖芽孢杆菌菌株通过微生物发酵制备胞外多糖，通过筛选优化培养基，改进生产工艺，得到高产、高纯度胞外多糖；该胞外多糖按照一定比例应用于叶面肥、滴灌肥、菌肥中，不仅可以保水改良作物生长环境， 而且对重金属吸附能力、抗真菌病强，可改善产品品质，提高产品产量。
具体实施例方式为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现该冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株，其分类命名为冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)，已于2010年12月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为 CGMCC No. 4519。所述冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株的菌落大小观-32讓，圆形，白色，边缘较整齐且呈隆起状，菌落表面有膜，膜下较湿润、呈粘稠状、透明，易挑取，显微镜下观察菌体呈杆状，芽孢中生，呈椭圆形。本发明冷解糖芽孢杆菌胞外多糖(以下简称HD-3多糖)生产工艺步骤为1)分离获得高效生产菌株——冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株可从黄豆酱中分离获得。2)制备种子培养液将菌株斜面接种于普通营养肉汤培养基，pH6. 8 7. 4，在温度30 35°C、170rpm转速、通风比1 1培养18 M小时，获种子培养液。3)发酵生产种子培养液以3% 10%的接种量接种于多糖发酵培养基中，培养基组分按重量比，以g/L为单位，分别为蔗糖5. 0 25，淀粉3. 0 10，豆粕5. 0 30，蛋白胨1. 0 10，碳酸钙2. 0 8. 0，磷酸氢二钾0. 5 1. 0，硫酸镁0. 5 1. 0，硫酸锰0. 001 0. 2，pH 7.0 8. 5。发酵温度24 32°〇、搅拌速度210卬111、通风比1 0. 3 0. 8发酵
3 5天。4)提取发酵液经高速离心去菌体，上清液真空浓缩至原液体积的三分之一，用 2 3倍的95 %乙醇沉淀，沉淀物采用sevag法去蛋白，经再次乙醇沉淀，沉淀物经等量的 75%乙醇洗涤2 3次，在60 70°C烘干，粉碎后得胞外多糖产品。用上述生产工艺发酵生产的HD-3胞外多糖一般含多糖90%以上，为酸性胞外多糖，其表面有丰富的羟基和羧酸基。本发明胞外多糖不仅对植物周边土壤、茎、叶具有良好的保水性，可以吸附重金属离子减少环境污染，而且还能抑制多种真菌病。将该胞外多糖作为一种新型功能性肥料添加剂，可广泛应用于叶面肥、滴灌肥、菌肥等肥料中，其应用前景广阔。以下给出HD-3胞外多糖保水性、吸附重金属离子及抑制真菌活性实验。1)HD_3胞外多糖保水性测定采用计算土壤水分蒸发速率的方式测定HD-3胞外多糖保水性。以长宽高均为10 厘米，体积为1立方分米的正方体为容器，土壤为普通黄土，经105°C，4小时烘干至恒重，填入容器压实，记下土壤质量(Ms)；以自来水为对照，使土壤充分吸水，记下所用自来水质量 (Mw)；分别以十万分之一(A)、万分之一⑶浓度的HD-3胞外多糖溶液为实验对象，将与对照相同质量的土壤和胞外多糖溶液填入空置容器，分别将其在30°C恒温放置3 15天，测定水分蒸发情况。通过测量放置若干天后，单位容器内土壤的质量(M)，经过下面公式计算出水分蒸发率。水分蒸发率的计算方法
权利要求
1.一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺，其特征在于所涉及的微生物为冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)，指定名称HD-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4519。
2.如权利要求1所述的冷解糖芽孢杆菌HD-3胞外多糖的生产工艺，其步骤为分离获得高产生产菌株——冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株；制备种子培养液；接种发酵罐生产；提取，烘干得胞外多糖。
3.如权利要求2所述的制备种子培养液，其特征在于将菌株斜面接种于普通营养肉汤培养基，pH6. 8 7. 4，在温度30 ;35°C、170rpm转速、通风比1 1条件下培养18 24 小时，获种子培养液。
4.如权利要求2所述的接种发酵罐生产，其特征在于种子培养液以3% 10%的接种量接种于多糖发酵培养基中，培养基组分以g/L为单位，分别为蔗糖5. 0 25，淀粉 3.0 10，豆粕5.0 30，蛋白胨1.0 10，碳酸钙2.0 8.0，磷酸氢二钾0.5 1.0，硫酸镁0.5 1.0，硫酸锰0.001 0.2，pH 7. 0 8. 5 ；发酵温度M 32°C、搅拌速度210rpm、 通风比1 0.3 0.8发酵3 5天。
5.如权利要求2所述的提取，烘干得胞外多糖，其特征在于发酵液经高速离心去菌体， 上清液真空浓缩至原液体积的三分之一，用2 3倍的95%乙醇沉淀，沉淀物采用sevag法去蛋白，经再次乙醇沉淀，沉淀物经等量的75%乙醇洗涤2 3次，在60 70°C烘干，粉碎后得胞外多糖产品。
6.如权利要求5所述的冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的应用，其特征在于作为一种功能性组分用于制备保水、吸附重金属离子及抗真菌病的肥料。
7.如权利要求6所述的冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的应用，其特征在于所说的保水、吸附重金属离子及抗真菌病的肥料为叶面肥、滴灌肥、菌肥。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺及其在肥料中应用。本发明冷解糖芽孢杆菌胞外多糖不仅对植物周边土壤、茎、叶具有良好的保水性，可以吸附重金属离子减少环境污染，而且还能抑制多种真菌病；将该胞外多糖作为一种新型功能性肥料添加剂，可广泛应用于叶面肥、滴灌肥、菌肥等肥料中，其应用前景广阔。本发明冷解糖芽孢杆菌胞外多糖的生产工艺为分离获得冷解糖芽孢杆菌HD-3菌株、制备种子培养液、发酵、提取、烘干即得多糖产品。由于本发明优化了培养基配方与生产工艺，此胞外多糖产量高、成本低，成品含多糖在90％以上。
文档编号C12P19/04GK102399839SQ20111012827
公开日2012年4月4日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者乔来艳, 刁红霞, 单俊伟, 宋海妹 申请人:中国海洋大学生物工程开发有限公司