专利名称：一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用。通过在 T. glabrataAura3的胞质当中构建一条异源苹果酸生产途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了苹果酸的积累，属于发酵工程领域。
背景技术：
苹果酸(Malic Acid)又名L-羟基苯二酸或羟基琥珀酸，被认为是以葡萄糖为原料通过生物化学转化的方法来获得的十大构架物质之一。它是生物体TCA循环的重要中间代谢产物，同时也是一种用量很大的酸味剂。早在1967年，就被美国食品和药品管理局确认为是是一种安全、无毒、可食用的有机酸。另外，苹果酸作为一种重要的有机酸，也被广泛应用于食品、医药、化工等领域。目前，随着石油资源的日渐枯竭，人们对苹果酸的需求也日益增加。在国内外，生产苹果酸的方法主要有以下四种(1)由丝状菌及酵母菌发酵，将多糖降解为苹果酸；(2) 培养细菌，由菌体内的延胡索酸酶将加入的延胡索酸转化成苹果酸；C3)固定化延胡索酸酶，将延胡索酸转化成苹果酸；(4)利用根霉将葡萄糖降解为延胡索酸，再利用变形杆菌进行混合培养，将延胡索酸转化成苹果酸。由于T. glabrataAura3具有强大的丙酮酸生产能力，这为生产下游代谢产物提供了一个广阔的平台。鉴于此，本研究将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的丙酮酸羧化酶基因(PYC2)和来源于米根霉(lihizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因 (RoMDH)过量表达于丙酮酸生产菌T. glabrataAura3中，在其胞质当中构建反向TCA的代谢途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了苹果酸的积累。
发明内容
本发明的目的是提供一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用。利用分子生物学手段，在多重营养缺陷型的丙酮酸生产菌一光滑球拟酵母当中，过量表达来源于来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸羧化酶基因(PYC2)和来源于米根霉(lihizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)，达到积累苹果酸的目的。本发明的技术方案为1)从米根霉(lihizopus oryzae)的基因组当中，调取苹果酸脱氢酶基因(RoMDH， 1014bp)2)利用PCR技术，扩增RoMDH3)将扩增得到的 RoMDH 连接 pMD18 T-vector4)将步骤幻连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板， 挑取转化子5)提取含RoMDH基因的质粒，并对两质粒双酶切、回收、纯化后，再连接以构建完成的游离表达载体PY^⑶P-PYC2
6)将步骤幻连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板， 挑取转化子7)提取质粒，酶切验证8)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布tea缺陷平板9)验证所述工程菌10)摇瓶发酵，验证苹果酸的生产情况
图 1TEF-RoMDH-GPD_PYC2 质粒图谱图2 菌落PCR验证与双酶切验证A 表达载体 pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2 导入 Τ. glabrata Δ ura3 的菌落 PCR 验证B 双酶切验证 RoMDH 连入 pY26 GPD-PYC2ΜIOkb marker1 质粒 pY262 质粒 pY26 GPD-RoMDH3 出发菌株 Τ· glabrata Δ ura34-5 重组菌株 Τ· glabrata FMME0466 质粒 py26 gpd-pyc27 双酶切质粒 py26 tef-romdh8 双酶切质粒 pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC29 RoMDH 的 PCR 产物
具体实施例方式实施例1产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建1)构建游离表达载体 pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2将已经连入pMD18 T-vector的RoMDH基因，经限制性内切酶NotI和^icII进行双酶切、回收、纯化，连接已构建完成的游离表达载体PY26 GPD-PYC2(16°C过夜)，进而构建游离表达载体 pY26 TEF-RoMDH-GPD-PYC2。2)将步骤1)连接产物转化将连接产物转化到JM109感受态细胞中后，涂布带有氨苄抗性的LB平板，经37°C 过夜培养。3)提取质粒酶切验证挑取转化子提取质粒酶切验证，发现均为阳性克隆，表明PY^ TEF-RoMDH-GPD-PYC2 已构建成功。4)将构建好的质粒采用电转化法导入受体菌当中，涂布tea缺陷平板，长出菌落后传代3次以上。5)验证所述工程菌挑取适量转化子接种于选择培养基，培养24h后，提取质粒酶切验证，得到所需重组菌株 T. glabrata FMME046。
实施例2利用光滑球拟酵母工程菌生产苹果酸从甘油管中移取400 μ L光滑球拟酵母工程菌接入种子培养基QOmLAOOmL锥形瓶)，于30°C、200r/min条件下摇瓶培养24h后，以10%接种量(ν/ν)接入发酵培养基。摇瓶发酵500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，温度为30°C，转速200r/min，发酵时间为96h。 采用高效液相色谱(HPLC)测得苹果酸的产量为5mg/L，是出发菌株的5倍。
权利要求
1.一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用，其特征在于将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸羧化酶基因(PYC2)和来源于米根霉(lihizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)过量表达于丙酮酸生产菌 T. glabrataAura3中，在其胞质当中构建了一条异源苹果酸生产途径，实现了碳代谢流的重新分配，促进了苹果酸的积累。
2.权利要求1所述产苹果酸工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)游离表达载体pY^TEF-RoMDH-GPD-PYC2的构建；2)将步骤1)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子；3)提取质粒pY^ TEF-RoMDH-GPD-PYC2，酶切验证；4)将构建好的游离表达载体pY^TEF-RoMDH-GPD-PYC2采用电转化的方法导入受体菌T. glabrata Δ ura3中，涂布Ura缺陷平板；5)验证所述工程菌；6)摇瓶发酵，采用HPLC测定苹果酸的产量。
3.权利要求1所述产苹果酸工程菌，在发酵生产苹果酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其发酵生产工艺1)种子培养从甘油管中移取400μL光滑球拟酵母工程菌接入种子培养基 (20mL/200mL锥形瓶)，于30°C、200r/min条件下摇瓶培养Mh ；2)摇瓶发酵以10%接种量(ν/ν)接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，温度为 300C，转速200r/min，发酵时间为96h。
全文摘要
本发明公布了一株产苹果酸的光滑球拟酵母工程菌的构建方法及应用，属于发酵工程领域。本发明通过游离表达的方式，将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的丙酮酸羧化酶基因(PYC2)和来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的苹果酸脱氢酶基因(RoMDH)过量表达于丙酮酸生产菌T.glabrata的尿嘧啶(Ura)缺陷型T.glabrataΔura3中，获得了重组菌株T.glabrata FMME046。所述菌株用于发酵生产苹果酸，发酵96h后，发酵液中苹果酸产量比出发菌株增加了5倍，达到5mg/L，这为采用微生物发酵法生产苹果酸提供了一条新的途径。
文档编号C12N1/19GK102286388SQ20111016674
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者刘立明, 徐国强, 陈修来, 陈坚 申请人:江南大学