专利名称：一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用海藻糖(trehalose)诱导培养提高毕赤酵母菌种O0ZcAia cariMica)对水果采后病害防治效力的方法，属于水果采后生物防治领域。
背景技术：
水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，也是全球关注的问题。据报道，在发达国家有10% - 30%的新鲜产品由于采后病害导致腐烂，而在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，果实采后腐烂率则高达40% — 50%。国外水果贮藏保鲜量占水果总产量60%以上，目前我国果品贮藏量800多万吨，不到总量的15%，其中冷藏库和气调库的贮藏量为70万吨，仅占总产量的7%。我国水果采后损失一般在20% - 30%，高者甚至达到 50%。2007年3月国家统计局发布的《中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示，2006年我国水果总产量达17050万吨。据此估算，我国水果采后的损失每年将达到数百亿元人民币的水平。水果腐烂的主要原因在于病原微生物的致病作用，这些病原微生物主要有灰葡 11 iBotrytis cinerea ) > ^1{Rhizopus s toloniger ) > iPenicillium spp.)、 毛霉 iMucor spp.)、链格孢(Al ternaria spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)和软腐细菌 (.Erwinia )等。病原微生物对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如扩展青霉0°.权/？浙仰 )产生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢仪ci/^rea)产生的葡双醛霉素(botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温贮藏和化学杀菌剂处理。近年来低温贮藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果的需要。同时，在低温条件下仍有相当数量的致病菌能够在水果上生长，并造成水果腐烂。 例如，能引起多种水果灰霉病的灰葡萄孢、BotiyriS cinerea)，也称灰霉菌，在_0. 5°C时也能生长繁殖，引起许多水果腐烂变质，造成严重经济损失。而那些对低温敏感的水果，因只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏，病原物的生长、繁殖更不能得到有效地抑制，腐烂相当严重。长期以来，控制水果采后病害的主要措施是使用杀菌剂。化学杀菌剂对防治病害可以起到立竿见影的效果，但是，化学杀菌剂长期和大量的使用，不仅导致病原微生物产生抗药性，同时严重污染环境，有损于人类健康。美国国家科学院(National Academy of Scinces)的一份报告显示，在用于处理食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致癌危险。随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的日益增强，目前多种化学杀菌剂^WCaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用，其直接的后果是目前许多水果采后病害已经没有杀菌剂能予以控制。因此，各国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成果， 并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。
随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。国外方面， Sansone等从苹果表面分离得到的粘红酵母对由召OiiTiis Cinerea引起的灰霉病有显著的防治效果，在实验室条件下，其腐烂率与对照相比降低了 M%。Calvente等的研究也发现粘红酵母对水果采后青霉病害有显著的抑制效果。我国水果采后病害生物防治研究起步较晚，郑晓冬等在体外和体内抑菌试验中研究了粘红酵母对由指状青霉引起的柑桔青霉腐烂的抑制效果，发现粘红酵母在控制由指状青霉引起的柑桔腐烂中显示出了很高的抑菌活性，在25°C条件下，对照的发病率为10096，而使用IX IO8个/mL的菌悬液的发病率仅为45 %,而且随着酵母浓度的提高，发病率也有逐渐下降的趋势。张红印等研究了粘红酵母对草莓采后灰霉病的抑制效果，对草莓进行了前期的预处理后，接种IX IO9个/mL的菌悬液和IX IO5个/mL的病原菌孢子菌悬液分别在4°C下贮藏7天和20°C下贮藏2天后，发现接种粘红酵母的草莓，其腐烂率与对照相比分别降低了 95%和94.7 %。范青O001)等对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明季也蒙假丝酵母(Pandida guiliermondii), 柠檬形克勒克酵母iKloGckerei、汉逊德巴利酵母iPebaryomyces hansenii) 对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；Tian (2004)等研究，在甜樱桃采前喷洒1 X 108CFU/mL的丝孢酵母{Trichosporon / /"^肅)，罗伦隐球酵母{Cryptococcus laurentii)和红酵母 (Mhodotorula glutinis)，分别在25°C ,0°C以及气调贮藏下，丝孢酵母在果实上繁殖数量最高，抑菌效果最好；张红印等000 研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25°C下，梨灰霉病的发病率为16. 7%，结合CaCl2使用效果更显著。从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于采后水果病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市， 而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。为了尽快地将拮抗微生物应用于水果贮藏保鲜实际生产上，还需进一步筛选拮抗效果好、抗病谱广的微生物，并进一步提高拮抗酵母的拮抗效力，从而将其应用于水果贮藏保鲜。中国专利CN201010M0638公开了一种提高粘红酵母对水果采后病害的生物防治效力的方法，该方法利用壳聚糖诱导培养粘红酵母，提高粘红酵母的生物防治效力，从而达到保鲜水果的目的。本发明利用海藻糖诱导培养卡利比克毕赤酵母，提高卡利比克毕赤酵母的生物防治效力，与壳聚糖相比，海藻糖价格低廉，处理方法简单，且具有较好的生物防治效果。海藻糖是Wiggers于1832年从黑麦的麦角菌中首次提取的，随后发现它在自然界中的动植物和微生物中广泛存在，包括低等植物、藻类、细菌、真菌以及脊椎动物，特别是酵母、霉菌、蘑菇等真菌中，有时含量竟高达干重的15%以上。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以α -1，1糖苷键连接的非还原性双糖，结构稳定，化学惰性，无毒性， 对热、酸都非常稳定，是天然双糖中最稳定的糖质。它广泛存在于自然界中，其化学性质稳定，有稳定细胞膜和蛋白质结构的特性，可作为生物分子的保护剂。海藻糖的生物学功能使得其能在医学、农学、食品科学、分子生物学等具有广阔而诱人的运用前景。
本发明利用海藻糖来提高卡利比克毕赤酵母、Pichia caribbica )的拮抗效力，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。
发明内容
本发明在培养基中添加不同浓度的海藻糖，对毕赤酵母进行诱导培养，提供了一种提高毕赤酵母生物防治效力的方法。经海藻糖诱导培养的毕赤酵母，可以明显地抑制水果病原菌，防止水果采后腐烂。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。本发明同时提供了一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，按照下述步骤进行将卡利比克毕赤酵母G0ZcAia⑵riMica)活化，用NYTB培养基培养卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica),离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1 X IO8个/ mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡Imin后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。其中所述的NYTB培养基中碳源为0. 2% 一 1%的海藻糖和0% — 0. 8%的葡萄糖，即酵母膏5g，牛肉浸膏8g，海藻糖2 — 10g，葡萄糖0 — 8g，纯化水1000ml，pH自然。其中所述的卡利比克毕赤酵母iPichia caribbica )，保藏菌株编号为CGMCC No.3616。其中所述的水果优选苹果、桃或草莓。本发明的优点
(1)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母G^idia caribbica)为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体无害。(2)本发明所使用的海藻糖来源广泛，价格低廉，无毒无害。(3)本发明使用海藻糖诱导培养毕赤酵母，能增加其内源海藻糖含量的积累，从而提高毕赤酵母的拮抗活性。(4)本发明使用海藻糖诱导培养毕赤酵母，与传统的葡萄糖培养基相比较，可以显著提高卡利比克毕赤酵母O0Zdia caribbica)的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。(5)本发明使用海藻糖诱导培养后的毕赤酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
其中图1为不同浓度海藻糖诱导后的毕赤酵母对苹果青霉病的抑制效果；注CK 对照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB:碳源用1%的海藻糖(用NYTB 表示)。发病率是20°C放置7d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(p=0. 05)。图2为不同浓度海藻糖诱导后的毕赤酵母对苹果灰霉病的抑制效果；注CK 对照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB 碳源用1%的海藻糖(用NYTB表示)。发病率是20°C放置7d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(p=0. 05)。图3为不同浓度海藻糖诱导后的毕赤酵母对桃果根霉病的抑制效果；注=CK 对照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB:碳源用1%的海藻糖(用NYTB表示)。发病率是25°C放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(p=0. 05)。图4为不同浓度海藻糖诱导后的毕赤酵母对桃果青霉病的抑制效果；注CK 对照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB 碳源用1%的海藻糖(用NYTB表示)。发病率是25°C放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(p=0. 05)。图5利用海藻糖和壳聚糖诱导培养的毕赤酵母对草莓根霉病的抑制效果；注CK 对照；NYDB:用葡萄糖作为碳源培养的毕赤酵母；海藻糖碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；壳聚糖碳源用0.5%的壳聚糖和0.5%的葡萄糖。发病率是20°C放置3d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。
具体实施例方式通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。卡利比克毕赤酵母O0ZcAia caribbica)系本实验室筛选得到，现保存于位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏菌株编号为CGMCC No. 3616，于NYDA (NYDB培养基的基础上添加洲的琼脂(质量计))培养基4°C低温保存。NYDB培养基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml,自然pH。培养程序为(1)固体活化将毕赤酵母接种于NYDA培养基中，在培养48h ； (2)液体培养在250ml的三角瓶中装入50 ml的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的毕赤酵母，在200rpm，28°C条件下培养20h ； (3)诱导培养将上述培养混合物7000Xg 条件下离心lOmin，无菌蒸馏水洗涤两次，以去除培养介质，并用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5 X IO8个/mL。在250ml的三角瓶中分别装入50ml NYDB 培养基或海藻糖补充培养基(碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；碳源用1%的海藻糖(用NYTB 表示))，并加入上述浓度的酵母细胞培养液lml，然后在200 rpmJ8°C条件下培养Mh ;(4) 离心分离再悬浮上述不同处理酵母培养混合物在7000 Xg条件下，离心10-15min，并用无菌蒸馏水洗涤2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为1 X IO9个/mL，再用灭过菌的生理盐水稀释到所需浓度。
其中使用的海藻糖购自广西南宁杰沃利生物制品有限公司。实施例1 海藻糖诱导培养毕赤酵母对水果病害的抑制效果
一、试验方案
水果处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口。其中草莓的表面伤口为3mm (直径)X 3mm (深)，桃果的表面伤口为5mm (直径)X 3mm (深)，苹果的表面伤口为5mm(直径)X5mm(深)。每个伤口处等量加入30 μ 1( 1)经NYDB培养基培养的酵母悬浮液；(2)经海藻糖补充培养基(碳源用海藻糖和葡萄糖)培养的酵母悬浮液；(3)无菌水(作为对照)。；Bh后，在每个伤口处加入等量30 μ 1的病原菌孢子iM. cinerea 浓度为 1 X IO5 spores mr1 ；/7. expansum WM为 5 X IO4 spores/ mL, R. stolonifer ^c 度为IXlO4 spores/ mL)( spores/ mL表示Iml中霉菌孢子的个数)。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养(湿度95%)，桃果置于25°C，草莓和苹果置于 20 0C ο每处理重复3次，每次重复18个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养， 记录果实发病率，以此评价卡利比克毕赤酵母A ^riMica的抑菌效果。发病率的计算公式如下
发病率(%)=发病的果实/接种病原菌的果实总数X 100%
二、试验结果
按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下 1.1对苹果青霉病及灰霉病的抑制效果
从图1和图2中可以看出，毕赤酵母经海藻糖诱导培养后，其对青霉和灰霉的发病率显著降低，特别是当使用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖做为碳源培养酵母时，其青霉和灰霉的发病率仅为11. 11%和8. 34%，显著地低于对照苹果及不经海藻糖诱导培养的毕赤酵母处理的苹果的青霉和灰霉病的发病率。
1. 2对桃果根霉病及青霉病的抑制效果
由图3和图4的试验结果表明，通过添加海藻糖诱导培养能显著提高毕赤酵母对苹果及桃果由灰葡萄孢、葡枝根霉及扩展青霉引起的病害的控制效力，最佳诱导量为0. 5%。实施例2 海藻糖诱导培养毕赤酵母对水果贮藏品质的影响一、试验方案
试验水果采摘后直接用以下处理浸泡果实lmin =(I)NYDB培养基培养的毕赤酵母悬浮液；(2)海藻糖补充培养基(用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖)培养的的酵母悬浮液；(3) 无菌水(作为对照)。然后将果实放在塑料筐内，风干后用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养 (湿度95%)，草莓，苹果置于20°C，一段时间后进行贮藏品质分析。每处理重复3次，每次重复10个果实，整个试验重复2次。贮藏品质分析方法如下
(1)失重率称重法。失重率=(处理前质量-储藏后质量)/处理前质量X100%
(2)硬度采用TA-XT2i质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的运行速度分别为4. Omm s^U.Omm Omm s—1，草莓测试深度为6 mm，苹果测试深度为 10mm，探头插入水果时所受的最大阻力(单位为牛顿)就被定义为水果的硬度。每个水果绕赤道处每120°测定3次。
(3)总可溶性固形物采用WYT (0-80%)手持糖量计进行测定，测定结果表示为 g/100g 样品。(4)可滴定酸度(％):采用滴定法，从6个果中称取20 g果肉，加蒸馏水20ml勻浆，用40ml蒸馏水洗入IOOml容量瓶。置于80°C水浴浸提30min，每隔5min搅拌一次，取出冷却，定容至刻度。过滤，取20 ml滤液置于IOOml小烧杯中，测定草莓时投入一片红色石蕊试纸，测定苹果时加入三滴酚酞指示剂，用0. 1 mol Γ1 NaOH进行滴定。当石蕊试纸变蓝或溶液至微红时为滴定终点。草莓以含柠檬酸百分含量表示，苹果以含苹果酸的百分含量表示。每处理3次重复。(5)维生素C含量的测定紫外快速测定法。从6个水果上取20g果肉样品加20ml 1%盐酸勻浆，50ml容量瓶定容至刻度。10000Xg，4°C条件下离心10 mim，上清用于测定。 取0. 4 ml提取液，放入盛有0. 8 ml 10% HCl的10 ml刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度后摇勻。以蒸馏水为空白，在M3nm处测定吸光度。另吸取0.細1提取液，分别加入細1蒸馏水和1. 6 ml Imoir1 NaOH溶液至IOml至刻度试管，摇勻，静置15min后。加入1. 6 ml 10%HC1，混勻，加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白，在M3nm处测定吸光度。由待测液及碱处理待测液的A243值之差，查标准曲线，计算样品中维生素C的含量。每处理3次重复。(6)褐变度6个水果称取20 g果肉组织，加入40ml蒸馏水勻浆，10000Xg，4°C条件下离心lOmim，取上清IOml加入95%乙醇15ml 10000 X g，4°C条件下离心lOmim，取上清液于420nm测定吸光度值，以此表示褐变程度。每处理3次重复。二、试验结果
按照上述步骤试验，统计苹果贮藏品质的结果如下 表1海藻糖诱导后的毕赤酵母对草莓储藏品质的影响
权利要求
1.一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于按照下述步骤进行将卡利比克毕赤酵母G0Zdia⑵riMica)活化，用NYTB培养基培养卡利比克毕赤酵 mPichia caribbica),离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1 X IO8个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡Imin后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。
2.根据权利要求1一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的NYTB培养基中碳源为0. 2% - 1%的海藻糖和0% - 0. 8%的葡萄糖，即酵母膏 5g，牛肉浸膏8g，海藻糖2 — 10g，葡萄糖0 — 8g，纯化水1000ml，pH自然。
3.根据权利要求1一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的卡利比克毕赤酵母O0ZcAia cariMica)，保藏菌株编号为CGMCC No. 3616。
4.根据权利要求1一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的水果为苹果、桃或草莓。
全文摘要
本发明公开了一种提高毕赤酵母对水果采后病害生物防治效力的方法。属于水果采后生物防治领域。将毕赤酵母活化，接种到添加有0.2%-1%海藻糖的NYTB培养基中进行诱导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1×108个/ml的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡1min后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。本发明使用海藻糖诱导培养提高毕赤酵母防治水果采后病害的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。诱导培养后的毕赤酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号C12R1/84GK102283281SQ20111016673
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者代春华, 任晓锋, 刘伟民, 张晓云, 张红印, 朱淑云, 赵利娜 申请人:江苏大学