专利名称：核酸检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸检测领域。
背景技术：
在分子诊断领域中，检测核酸内容物中的微小差异是一项重要的工作。检测少量核酸最常用的方法是PCR或RT-PCR。在测定给定样品中目标序列与否存在时，这些方法执行的特别好，但为了测定两条序列浓度之间是否存在差异，则需要大约 2倍的差异。核酸的定量分析在例如质量控制、基因表达分析、医疗监护以及诊断中使用。本文所述方法显著改善了这些测量的精确度，在科学和医药领域中开辟了新的潜在应用。
发明内容
在一方面，本发明提供了用于定量核酸样品中核酸序列数量的改良方法。该所要求保护的方法可使样品中具有给定序列的核酸的量的精确测定，包括小于2倍差异的精确测定成为可能。在一方面，该方法依赖于使PCR反应失平衡的方法。当反应以该方式失平衡时，在模板和互补链之间形成了不对称性，使随后反应中期望产物和不期望产物之间的区别成为可能，又使得核酸样品中非常小的核酸序列的量的差异的灵敏检测成为可能。因而，在一个实施方案中，提供了使PCR反应失平衡的方法，包含步骤a)在包括原始目标核酸序列(模板)、其互补核酸序列以及相应的第一和第二 PCR引物的PCR反应中产生产物；和b)添加过量的与第一和第二 PCR引物中的任一引物互补的核酸破坏序列。 在以下讨论中，破坏序列与第一引物互补。当破坏序列被容许在下一个退火循环中杂交时， 其通过退火至第一引物以及一条或另一条原始(模板)序列或其互补序列，而非两条序列 (取决于这两条链中哪条与破坏序列互补)，主要形成了破坏序列对。因随后延伸所产生的产物失平衡，而产生了或为模板或为其互补链的一条链，而非两条链。换句话说，在破坏序列杂交后的延伸基础上，主要产生了 a )在一条链中带有缺口的双链原始(模板)序列和单链互补序列，或b)在一条链中带有缺口的双链互补序列和单链原始(模板)序列。以单链或双链形式所产生的产物的特性是由两条PCR引物中与破坏序列互补的那一条所决定的。检测单链产物使靶序列原始的量的灵敏测定成为可能。在另一方面，提供了一种通过交联锁定双链DNA进而在反应混合物中用于阻断可能发生的基于PCR的扩增的方法。该交联阻止了扩增并由此在交联时检测双链DNA。该扩增的阻断可使更灵敏的未交联产物的检测成为可能。该交联可通过如UV或化学处理得以实现。
在另一方面，提供了一种用于测定在核酸样品中相对于参比核酸的量的靶核酸的量的方法。该方法包括对参比和靶核酸以及参比和靶核酸两者的正向和反向PCR引物的合并混合物进行PCR。参比核酸的反向PCR引物含有与靶核酸上所存在的序列相同的尾部 (tail)序列。在给定次数的PCR循环后，通过添加过量的两种核酸破坏序列并让它们与单链PCR产物杂交而破坏反应的对称性。第一破坏序列与靶探针的反向引物互补，第二破坏序列则与参比探针的反向引物互补，但不包括与靶核酸上所存在的序列相同的尾部区。在破坏后，检测留下的单链靶或参比核酸，使得相对于参比核酸的原始样品中的靶核酸的量得以测定。
图1显示了 PCR反应受控破坏以形成单链模板(ABC)和双链互补物(C' B' A') 的示意图。第一步显示了原始基因组DNA序列(也称为模板，ABC)和相应的正向和反向PCR 引物(分别为A和C)。在第二步中，显示了几次PCR循环的产物。在期望数目的PCR步骤完成之后，该示意图显示了以相对于PCR引物过量，添加与反向引物(C')互补的破坏序列 (C)0当冷却时，过量的破坏序列会结合反向引物以及互补序列。与此同时，正向引物则会结合互补序列并延伸，形成在B和C连接处带有缺口的双链互补物。因此，模板(ABC)得以保留单链。图2显示了如何使用交联从随后的PCR或其他检测反应中除去双链DNA的示意图。第1步显示了序列以单链和双链形式存在。添加交联剂永久性或半永久性将双链DNA 结合在一起，阻止了在PCR循环的高温步骤期间的完全解离(第3步)。其选择性地阻止了例如通过PCR的双链DNA扩增，但不限制单链DNA扩增。图3显示了与先前所能考虑到的技术相比能检测核酸内容物中更小差异的单管相对扩增(single tube relative amplification)技术的示意图。第1步显示了原料要比较的两条基因组DNA序列，以及相应的正向和反向PCR引物，参比序列的反向引物具有带有部分B序列的“尾部”。在进行几次PCR循环后，会产生第2步中所见的产物。如果在该步骤之后添加过量的C和F引物到反应中，则这些引物能与反向引物及互补序列杂交，使与新添加的C和F引物或之前添加的反向引物离开没有接触的模板链。然后，单链参比和靶模板可互相杂交并形成配对。任何未配对的参比或靶模板会保留单链。第4步显示了如果双链DNA被交联了所发生的一切。交联就不得不只发生在C/C'和pB/pB'序列上。如果发生永久性或半永久性交联，可使用跨越交联位点的引物进行直接PCR以只检测单链模板 (如所示的ABC)。图4显示了先交联双链模板对，然后利用PCR检测单链模板的实施方案的示意图。 该图显示了用于进一步分析的PCR引物的可能的选择，正向引物A和D已见于图3第4步中所见的最终样品，Rl和R2则稍后添加。如所示的，引物应当仅扩增单链模板，而不能扩增在上面所示的交联的双链模板。
具体实施例方式定义如本文所使用的，“多核苷酸”或“核酸”指共价连接的核苷酸序列(即对于RNA而言的核糖核苷酸以及DNA而言的脱氧核糖核苷酸)，其中一个核苷酸的戊糖的3'位与下一个核苷酸的戊糖的5'位通过磷酸二酯基团连接。术语“多核苷酸”包括不限于单链和双链多核苷酸。术语“多核苷酸”当其在本文中使用时，包括化学、酶或代谢修饰的多核苷酸形式，包括如DNA、RNA、PNA、这些的组合和/或含有一个或多个核苷酸类似物的聚合物。 如本文所使用的，“核苷酸类似物”指其中戊糖和/或一个或多个磷酸酯为其相应的类似物所取代的核苷酸。作为例证的磷酸酯类似物包括但不限于膦酸烷酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯 (phosphoroanilothioates)、酰基苯胺磷酸酯(pliosphoroanilidates)、氨基磷酸酯、二羟硼基磷酸酯等，如果存在的话，包括任何缔合的抗衡离子。还包括在“ 核苷酸类似物”定义中的是能聚合为其中DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯主链为不同类型的键所取代的多核苷酸类似物的核酸碱基单体。进一步包括在“核苷酸类似物”中的是其中核酸碱基部分为非常规的即不同于G、A、T、U或C任一的核苷酸。例如，可使用诸如溴脱氧尿苷的卤代核苷酸。 一般而言，非常规的核酸碱基应具有与存在于邻近的相反方向的多核苷酸链上的至少一个核酸碱基部分形成氢键或提供不互相作用的、非干扰性的碱基的能力。“多核苷酸”还包括短多核苷酸，常称为寡核苷酸(如引物或探针)。由于多核苷酸磷酸二酯键存在于取代的单核苷酸的戊糖环的5'碳和3'碳上，因此多核苷酸具有 "5'-末端”和“3' _末端”。在新的键将要在其上成为5'碳的多核苷酸的末端，是其5' 末端核苷酸。在新的键将要在其上成为3'碳的多核苷酸的末端，是其3'末端核苷酸。如本文所使用的，末端核苷酸是位于3'-或5'-末端末端位置的核苷酸。如本文所使用的，多核苷酸序列，甚至于较大的多核苷酸(如多核苷酸中序列区)内部，也可被说成含有 5'-禾口 3'-末端。如本文所使用的，术语“化学修饰的”当用于上下文的核苷酸时，指相对于标准的 ATP、CTP、GTP、UTP、dATP、dCTP、dGTP或dTTP核苷酸，在至少一个化学键中具有差别的核苷酸。“化学修饰”并不指当核苷酸通过5' -3'磷酸二酯键掺入到多核苷酸中时所发生的修饰。如本文所使用的，术语“杂交”用于指当链相互反平行排列时，通过在互补核苷酸之间形成氢键的互补(包括部分互补的)多核苷酸链的物理相互作用。杂交和杂交强度 (即多核苷酸链之间的缔合强度)受本领域众所周知的诸多因素影响，包括多核苷酸之间的互补性程度，以及所用条件的严格程度，其受诸如盐浓度的影响、其他成分的存在(如聚乙二醇存在与否)、杂交链的摩尔浓度以及多核苷酸链的G+C含量的条件，所有这些条件决定了所形成的杂交体的特征解链温度(Tm)。如本文所使用的，当一个多核苷酸被说成与另一个多核苷酸“杂交”时，其意指在高严格条件下这两个多核苷酸形成氢键键合的反向平行杂交体。杂交需要在要杂交的多核苷酸之间部分或完全的序列互补性。当一个多核苷酸被说成不与另一个多核苷酸杂交时， 其意指在高严格条件下在这两个多核苷酸之间没有足够的序列互补性用于形成氢键键合的杂交体，或在这两个多核苷酸之间没有杂交体形成。如本文所使用的，“特异性杂交”指核酸分子只针对靶和非靶核酸序列混合物中的靶核酸序列而不针对其他非靶核酸分子的结合、双螺旋化或杂交。如本文所使用的，术语“低严格”、“中等严格”、“高严格”或“非常高严格条件”描述了用于核酸杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的教导可见Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6，其全文在此并入作为参考。用水和不用水的方法描述于该参考文献中并可使用任一方法。本文所提及的具体杂交条件如下(1)低严格杂交条件为于约45°C在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着于至少50°C在0. 2X SSC、0. 1% SDS中两次洗涤(对于低严格条件洗涤温度可增加到55°C )； (2)中等严格杂交条件为于约45°C在6X SSC中杂交，接着于60°C在0. 2X SSC.0. 1% SDS 中一次或多次洗涤；(3)高严格杂交条件为于约45°C在6X SSC中杂交，接着于65°C在0.2X SSC、0. 1% SDS中一次或多次洗涤；和(4)非常高严格杂交条件为于65°C在0. 5M磷酸钠、 7% SDS中杂交，接着于65°C在0. 2XSSCU% SDS中一次或多次洗涤。
如本文所使用的，“分离”自样品的多核苷酸是已从正常细胞或非细胞环境取出的样品中天然存在的多核苷酸序列。因此，正常细胞环境中“分离的”的多核苷酸可处于无细胞溶液中或可置于不同的细胞环境中。同样地，正常非细胞环境中“分离的”的多核苷酸可处于不同的无细胞溶液中或可置于细胞环境中。如本文所使用的，术语“血液”、“血浆”和“血清”明确地包含其级分或经处理的部分。同样地，在取样自活组织检查物、拭子、涂片等情况下，“样品”明确地包含来自活组织检查物、拭子、涂片等的经处理的级分或部分。如本文所使用的，在上下文中的样品中，“至少部分地”获得自给定来源的样品包含至少一种获得自这样的来源的样品成分。如本文所使用的，“互补”序列指其中一条链上的A残基与另一条链上的T或U残基以及一条链上的G与另一条链上的C残基反向平行配对并列，使得A:T、A:U和G:C氢键键合的碱基对得以形成的序列。这些碱基对是在体内大多数DNA和RNA杂交体中存在的标准“沃特森-克里克”碱基对。除非另有陈述，如本文所使用的，术语“互补”，当用于描述相对于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列时，本领域技术人员应当清楚其指在某些条件下包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双螺旋结构的能力。“互补”序列还可包括非沃特森_克里克碱基对和/或包括由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由上述碱基对形成，只要在上述就其杂交能力的要求得到满足的范围内即可。就双链核酸杂交体的有义链和反义链之间的碱基配对而言，可使用本文中的术语 “互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”。“完全互补的”杂交体其一条链上的每个核苷酸都与相对链上其并列的对应核苷酸碱基配对。在“基本上互补的”杂交体中，两条链可完全互补，或杂交时它们可包括一个或多个，但优选不超过10个错配的碱基对，但在用于本文所述方法的条件下保留有杂交的能力。如本文所使用的，“染色体异常”指给定人群中最普遍的组成或结构的染色体的 DNA组成或结构中的任何偏差。其包括但不限于缺失、突变、重复、重排、共价修饰、单亲二体以及改变的染色质结构。本文所述的方法尤其适合于检测异常染色体计数(如唐氏综合征、克兰费尔特综合征、帕韬综合征、爱德华综合征、特纳综合征、X三体综合征、XYY综合征等)和异常序列计数(仅有一部分染色体以异常数量存在的异常)。术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多个、优选多于三个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子。其确切大小取决于许多因素，依次又取决于寡核苷酸的最终功能和应用。用于本文所述方法中的寡核苷酸的长度最通常为15-600个核苷酸。如本文所使用的， 术语“引物”指无论是在纯化的限制酶切消化中以天然形式存在的还是通过合成产生的，能作为模板依赖性核酸合成的起点起作用的寡核苷酸。引物可以是单链或双链引物，并且必须足够长，以在所选择的聚合酶存在下引发期望的延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括杂交和聚合温度、引物来源以及所使用的方法。例如，为了诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多的核苷酸，虽然其可含有更少或更多的核苷酸。涉及确定引物适当长度的因素易于 为本领域技术人员所知道。如本文所使用的，“个体”指人受试者以及非人受试者，例如哺乳动物、无脊椎动物、脊椎动物、大鼠、马、狗、猫、牛、鸡、鸟类、小鼠、啮齿动物、灵长类动物、鱼类、蛙、鹿、真菌、酵母、细菌和病毒。在此的例子并不意在限制本发明的方法学仅用于人受试者，该方法学还可用于兽医学、畜产学、研究实验室等领域。如本文所使用的，“诊断”指证明个体具有特定状况的可能性增加的能力。诊断也指证明个体不具有特定状况的可能性增加的能力。更具体来说，“诊断”指证明相较于另一种状况个体具有一种状况的可能性增加的能力。更具体来说，“诊断”指籍此个体被正确地鉴定为具有状况(“真阳性”)或不具有状况(“真阴性”)的可能性增加，与此同时使个体被不正确地鉴定为具有所述状况(“假阳性”)或不具有所述状况(“假阴性”)的可能性最小化的过程。如本文所使用的，术语“相应于”指当第一核酸和参比核酸序列比对时，第一核酸序列中的核苷酸与参比核酸序列中的给定核苷酸对准。例如，本领域技术人员使用设计用于该目的的软件可进行比对。作为一个核苷酸“相应”的例子，序列5' -GTATCACTGA TAAAGGAGAA-3 ‘ (SEQID NO :1)第 11 位的 T"相应于”Gen Bank 登陆号 GI 1552506 的 TCRB 第27，091位的T核苷酸，反之亦然。术语“相应的”也指例如两个特异性结合配偶体之间的相互关系，即结合配偶体对的一个成员“相应于”该配偶体对的另一个成员。如本文所使用的，当用于探针浓度时，短语“接近所存在的参比或靶序列的量”意指所讨论的探针的浓度相当于在任何一个被讨论的参比或靶序列浓度的80%范围内。如本文所使用的，“探针”指具有或含有与另外的多核苷酸如靶多核苷酸或另外的寡核苷酸互补的序列的一种类型的寡核苷酸。用于本文所述方法中的探针的长度理想地小于或等于600个核苷酸，通常在40-600个核苷酸之间。如本文所使用的，短语“成对探针”指在物理上相关或彼此结合的两条探针。成对探针可通过两个如本文所定义的术语_结合配偶体部分的缔合而彼此结合，所述缔合包括但不限于通过核酸杂交体的形成、通过共价化学键结合或通过蛋白_蛋白相互作用结合。 术语“成对探针”不但包括以1 1相互关系配对的探针，还包括以高阶相互关系如1 2、 1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8等缔合的探针(即一个分子的一条探针与2、3、4、 5、6、7或8个分子等的另一条探针配对)，只要对于给定的探针组比率是已知的或至少不变即可。“不成对探针”是在物理上与另一条(如第二)探针并不相关或没有与之结合的探针 (如第一探针)。可通过一个或多个衔接分子发生“配对”。如本文所使用的，短语“使杂交探针抗检测”和“使成对探针抗检测”指在用于检测不成对探针的核酸检测方法中，使得杂交或成对探针基本上不被检测的处理。“基本上不被检测”意指在用于检测不成对探针的核酸检测方法中，被处理以抗检测的杂交或成对探针对信号的贡献小于10%，以及优选小于2%。当用于探针时，短语“使杂交探针抗检测”相当于术语“隐藏”或“掩蔽”。使杂交探针抗检测的处理的非限制性的例子包括探针与靶或参比序列或与另一条探针进行化学和U. V.交联，或物理除去所述杂交或成对探针。如本文所使用的，“结合配偶体”或“结合配偶体部分”指特异性结合对的一员。特异性结合对是一对在给定的一组条件下彼此特异性结合的部分；“特异性结合”指结合对中的一个成员与另一成员结合，基本上把与存在于该环境中的其他部分的结合排除在外。如本文所使用的，短语“容许第一结合配偶体部分与第二结合配偶体部分相互作用的条件”指利于特异性结合对的两个成员物理和/或化学相互作用那些环境条件。取决于结合对相互作用的 性质，这样的条件会有所变化，但可为本领域技术人员所确定。代表性的条件包括当例如结合配偶体是互补核酸序列时，如本文中所述的或本领域已知的杂交条件，如高严格或低于其的条件。这样的条件还包括基本上不存在竞争序列的条件，所述竞争序列包括存在于要测定靶序列的量的核酸样品中的序列。在本文所述的方法中，在容许第一结合配偶体部分与第二结合配偶体部分相互作用的条件下，引入结合配偶体部分或包含它们的探针的步骤可作为独立的步骤进行，如在将探针与样品核酸接触之后进行，或可在这样的接触过程中进行。如本文所使用的，术语“靶核酸”指相对于“参比核酸”，在样品中其的量待测定的多核苷酸。“靶核酸”含有至少20个核苷酸、优选至少50个核苷酸、更优选80-500个核苷酸但可以更长的已知序列。本发明的“靶核酸”可以是天然存在的多核苷酸(即存在于无人为干预的自然界中的)多或重组多核苷酸(即只在人为干预下存在的多核苷酸)，包括但不限于基因组DNA、cDNA、质粒DNA、总RNA、mRNA、tRNA、rRNA。靶多核苷酸还包括其自身的扩增产物，例如，作为聚合酶链反应扩增的产物。如本文所使用的，“靶多核苷酸”或“靶核酸”可含有包括硫代磷酸酯、亚磷酸酯、环原子修饰的衍生物等的修饰的核苷酸。靶核酸序列必须不同于参比核酸序列，这样在严格条件下靶和参比核酸序列才不会彼此杂交。如本文所使用的，术语“交联”指在两个探针之间特异性物理相互作用之后，一个探针与另一个探针的共价键合。“同源性”或“同一性”或“相似性”指两条核酸或多肽序列之间的序列相似性。可通过比较为了比较的目的而比对的每一条序列中的位置来测定同源性。当所比较的序列的一些位置为相同的碱基或氨基酸所占据时，则这两个分子在序列上是同源的。序列之间同源性的水平是序列所共享有的匹配或同源位置数目的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与另外的序列共享有小于40%的同一性，然而优选小于25%的同一性。如本文所使用的，术语“生物流体”指采自生物源的流体并包括例如血液、血清、血浆、痰液、灌洗液、脑脊液、尿、精液、汗、泪液、唾液等。如本文所使用的，短语“抗核酸酶切割”意指与没有修饰或结构属性的类似序列相比，所给定的核酸探针含有一个或多个使其较不易受核酸酶切割的化学修饰或结构属性。 非限制性的例子包括对磷酸二酯键的改变如包含硫醇键，以及存在二级结构如探针分子的全部或部分单链的双链。“较不易受”意指在相同的核酸酶切割条件下，相对于非修饰的探针少至少10%的切割事件。如本文所使用的，术语“非整倍性”指具有的染色体数目不是物种的单倍体数的倍数的状态。例如，具有不同于(如大于或小于)染色体单倍体数的二倍数的染色体总数的二倍体细胞或生物体为非整倍体。如本文所使用的，“聚合酶链反应”或“PCR”指一种用于扩增特定多核苷酸模板序列的体外方法。PCR反应包括一系列重复的温度循环，且通常在10-100 μ 1的体积中进行。 反应混合物包含dNTPs(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶如热稳定的DNA聚合酶以及多核苷酸模板。一次PCR反应可由例如多核苷酸分子的5-100次变性和合成的“循环”组成。如本文所使用的，“发夹序列”包含两条可形成由环序列所分隔开的双链茎区的自互补序列。包含双链茎区的寡核苷酸的这两个区基本上彼此互补，形成自杂交。然而，该茎区可包括一个或多个错配、插入、侧环(sideloops)或缺失。如本文所使用的，“发夹序列” 可额外包含从双链茎区段延伸的单链区。
详述于有利的时间使PCR反应失平衡以使反应过程重新定向尽管在分子生物学中PCR是通常可接受的方法学，但在过去20年间隐藏在该方法学之后的基本原则变之甚少。主要原因是PCR为分子生物学群体提供了很好的服务。其是一种能检测非常低的核酸序列数量的工具，其甚至还能提供大致的定量分析。然而，围绕着在最终的PCR混合物中形成大量副产物的这样一个PCR重复发生的问题使得这些PCR产物在许多应用中不能使用。本文描述的是一种PCR反应能选择性失平衡的方法。如本文所使用的，关于PCR 的术语“失平衡(unbalancing或misbalancing) ”指使用PCR或其变型以产生含有单链和双链核酸的扩增产物，即产生单链模板和双链互补物或产生双链模板和单链互补物。该失平衡的目的在于促进模板和其互补物之间的差异，由此容许与其中之一而非他者的下游反应。在几个PCR循环后，反应混合物含有各类产物。一种在该阶段使反应失平衡的方法是导入正向或反向引物(或可能地，两者)的过量的全长或部分互补物。所添加的过量弓I物在本文中称为“破坏序列(disrupt sequence或disruption sequence)，，。如果该破坏序列被容许与单链PCR产物杂交，一半的产物就会转变成双链，而另一半的产物则仍保留单链(图1)。注意到双链互补物或模板并不是连续的链，而是在破坏序列遇到不与其互补的原始引物的延伸物时，在序列中具有缺口。因此，通过使最终PCR反应失平衡的简单方法，能将预期PCR产物和其互补物区分开。从利用需要单链DNA的PCR或其他方法的未来的检测中敲除核酸一旦达到期望产物为单链而不期望产物为双链的状态，就可通过永久性或半永久性的(即稳定的)交联锁定双链核酸(图2)。交联的双链DNA则会随后在需要单链形式的大多数反应例如核酸杂交、与某些特异于单链核酸的荧光染料相互作用、PCR以及PCR多种改良型中成为无活性的角色。因此，通过交联本质上所实现的是通过现有不必要的互补物抑制进一步的活性以及分离期望产物用于进一步的试验或其他应用。使用PCR失平衡和交联来检测核酸内容物中的微小差异对于诸多诊断和研究方法，检测核酸内容物中的微小差异或提供低浓度核酸的精确定量是一个主要的目标。以下所描述的方法通过化学计量的配对(无须一对一的)消除共同背景，从而比较了两条核酸的相对浓度。以下描述讨论了一对一的核酸配对并为了举例说明的目的引用了图3以及图3中所使用的符号。 对于该方法，假定待互相比较的两条核酸-靶(ABC)和参比(DEF)都处于低浓度。 通过进行PCR，可增加期望序列的量。现在假定进行这样的PCR步骤，以致于参比序列的反向引物(F')被修饰以包括大致相当于靶模板(B)上的区域的部分序列(pB)。对于大致相当的，意指应结合靶模板(B)上原始序列期望区域的大致相当的部分序列(pB')的互补物。该参比模板的反向引物称为PBF'。在几步PCR后，如2、3、4、5、10、15步等之后，可在混合物中找到如图3第2步所示的产物。困难在于由于约束许多随后使用的方法学的众多能结合我们所期望的产物的片段的存在而导致了许多未来的分析的禁止。这就是使PCR反应失平衡变成重要的原因所在。通过添加靶的反向引物(C')和参比的反向引物(F')的过量的互补物(C，F) 并建立杂交条件，促进这些引物形成双链。如果条件正确，则反向引物上的随后延伸会使PB 区与pB'互补物形成双链。C和F称为破坏序列。在杂交/延伸条件下，破坏序列不会因两种反向引物形成双链而停止作用。它们还会结合到互补模板(C' B' A'和pBF' E' D') 上，并且参比模板上的短的延伸会与PB序列形成双链。正向引物不会仍都保持无活性。它们最终(尽管由于相对浓度，而在统计学上稍迟)会同样地找到互补模板，并且，通过杂交和延伸，它们会与剩余的互补模板形成双链，在正向引物的延伸物遇到破坏序列时，在新双链中具有小的中断。既然更高浓度的破坏引物和正向引物各行其事，那么原始模板就有时间和空间彼此结合并以预定的1 1比率延伸。所留下的示于图3的第3步中。由于原始模板的1 1 配对，如果靶过量，则单链ABCs剩余。如果参比过量，则单链DEFpB'剩余。即使模板配对反应并不完全，通过保持绝对差异并减少相等绝对量的共同背景，靶和参比模板之间的相对差异还会增加。下一步是在进一步反应中“隐藏”双链核酸。其可通过例如选择性地、从物理上除去它们、通过酶降解它们或交联它们而得以实现。在图3第4步中，显示了通过永久性或半永久性地使它们彼此交联而“隐藏”双链核酸。如果随后的检测方法是特异性针对单链DNA 或能变成单链的DNA，则可成功地除去来自所有双链体的相互作用。一种在永久性或半永久性交联后运行良好的检测工具是PCR。通过PCR可容易地检测到很少量的核酸的大的相对差异，尽管对于PCR必须阻止双链分子的进一步交联。在之前的描述中，靶和参比模板的正向引物(分别为A和D)业已存在。仅需要添加新的反向引物(图4)。上述方法能进行简单修改，使得靶和参比互换，或聚焦于回收互补序列，而非原始模板序列。在另一个实施方案中，能创建其中待与靶核酸相比的参比核酸是具有已知浓度的标准稀释物一部分的系统。这就容许通过测定靶核酸所落入的两个标准浓度并可能通过观察靶和参比核酸的最终相对量，来估计例如与任一或两个标准浓度之间的距离，从而精确地给出核酸浓度范围。核酸样品
应用于本文所述方法的核 酸样品可来自于任何来源。通常，样品可以是与其天然环境所相分离并包含多核苷酸的生物材料。样品可由纯化的或分离的多核苷酸组成，或可包含生物样品例如包含多核苷酸的组织样品、生物流体样品或细胞样品。生物流体包括作为非限制性例子的血液、血浆、痰液、尿、脑脊液、灌洗液及白细胞去除(leukophoresis)样品。核酸样品可来自于植物、动物、细菌或病毒来源。样品可获得自不同来源，包括但不限于来自不同个体、相同或不同个体的不同发育阶段、不同患病个体(如患有癌症或怀疑患有遗传病症的个体)、正常个体、相同或不同个体的不同疾病阶段、进行了不同疾病处理的个体、处于不同环境因素的个体、或具有易患病体质的个体、或暴露于传染性疾病介质(如 HIV)的个体的样品。样品还可获得自体外培养的组织、细胞或其他含有多核苷酸的来源。所培养的样品可采自包括但不限于在不同培养基和条件(如PH、压力或温度)中保持的培养物(如组织或细胞)、保持不同时间长度的培养物(如组织或细胞)、用不同因子或试剂(如药物候选物或调节剂)处理的培养物(如组织或细胞)、或不同类型组织或细胞的培养物的来源。此外，样品可作为多核苷酸合成的产物而获得。样品优选包含从上述来源中分离的核酸。从生物来源中分离核酸的方法是众所周知的，并可依来源的性质而改变。本领域技术人员能容易地从来源中分离本文所述方法需要的核酸。在某些情况下，断裂核酸样品中的核酸分子可能是有利的。断裂可以是随机的， 或可以是特异性的，可通过例如使用限制性内切酶消化来实现。用于随机断裂的方法是本领域众所周知的，包括例如受限的脱氧核糖核酸酶消化、碱处理和物理剪切。在一个实施方案中，样品收集自怀孕的雌性动物，例如孕妇。在该例子中，可使用本文所述方法分析样品以在产前诊断胎儿中的染色体异常。样品可收集自生物流体，例如血液、血清、血浆或它们的某些级分。在一个优选的实施方案中，样品由分离自孕妇血液的纯化的核酸组成。对血浆DNA的分析揭示了其主要由短DNA片段组成，有趣的是，与非孕妇相比，孕妇中平均片段大小更大。此外，似乎孕妇血浆DNA中的胎儿片段平均较母体片段为短(Chan 等，2004，Clin. Chem. 50 :88_92)。用于从血液、血清或它们的经处理的级分中分离核酸的方法是本领域众所周知的。从血液或血清中分离核酸的方法描述于例如Chen等，1996，Nature Med. 2 1033-1035 和 Lo 等，1997，Lancet 350 485-487 中。Lo 等的参考文献明确地验证了胎儿DNA在母体血浆和血清中的存在。此外，Dhallan等(2004，J. Α. Μ. A. 291 :1114_1119) 和TO 95/08646描述了从母体血清中富集胎儿DNA的方法。虽然对于本文所述的产前诊断实施方案，这样的富集并不是必需的，但是在本文所述方法的某些方面中这样的富集可能有利。还可从母体循环中选择并获取胎儿细胞(参见如Bischoff等，Hum. R印rod. Update 8，493-500 (2002)和 Merchant 等，Hum. R印rod. Update 8，509-521 (2002)，并可将其作为靴和参比核酸序列的来源。例如，分选的胎儿细胞可作为通过PCR获得的靶和参比序列的来源(参见如 Geifman-Holtzman 等，Am. J. Obstet. Gynecol. 174 :818_22 (1996))。如果胎儿是男性，则另一种途径使用来自Y染色体的参比序列；这样的序列可获得自母体循环中无细胞的胎儿 DNA (参见如 Sekizawa 等，Am. J. Pharmacogenomics 1 111-7 (2001))。除先天缺陷的早期检测之外，本文所述方法可应用于检测基因组中基因序列所表现的任何异常性。已表明来自癌症患者的血浆和血清含有可检测量的肿瘤DNA(Chen等，1996，Nature Med. 2 1035 ；Nawroz 等，1996，Nature Med. 2 1035-1037)。通过非整倍性、 或不适当数量的基因序列或甚至整个染色体鉴定肿瘤。因此，对来自个体的样品中所给定序列的量的差异的检测可用于诊断癌症。靶核酸本文所述方法利于与参比核酸序列相比的靶核酸的量的差异的检测。靶核酸包括任何与在健康个体和患病个体比较中所表现的序列差异有关的核酸序列。基因组DNA特别适用于作为靶和参比核酸的来源。因此，靶核酸序列可以是在疾病中错误表现的染色体上的序列，如表1中所注的染色体上的序列。靶序列还包括例如，已知以多态性状态存在的序列。靶序列还可包括例如，已知的待扩增的或在整个个体中没有过多出现但在个体的某些细胞中如在某些癌细胞中过多出现的序列。最后，靶序列还包括处于研究中的序列，例如差异基因表达的序列。可通过将本文所述方法应用于含有目标RNA源反转录反应产物的样品，测定相对于参比序列的RNA转录物的量。参比核酸本文所述方法中所称的参比核酸是与靶序列比较数量的序列。最通常地，参比序列应当是核酸样品中一种具有已知或预期表现的序列。对于基因组DNA，例如，参比序列可以是以每个基因组的单拷贝序列存在，如在杂合个体中，或以双拷贝存在，如在纯合个体中。在靶序列要以RNA来测定的情况下，例如在要测定给定信使RNA的表达水平的情况下， 参比核酸可以是例如，管家基因序列如GAPDH、肌动蛋白或组蛋白序列，或表达水平已知的另外的序列，或表达水平至少已知是相对不变的另外的序列。最通常地，参比序列应当是一种业已存在于生物样品中的序列，优选处于已知的表现下。例如，在希望研究与诸如指示唐氏综合征的21号染色体三体性的遗传病症有关的序列的量的情况下，参比序列应当是不存在于21号染色体上的序列，而靶序列则应当是存在于21号染色体上的序列。在该例子中，当参比序列以双拷贝(纯合序列)存在时，如果使用本文所述方法发现与参比序列相比，在母体血清中靶序列丰度更高，则该数据应当指示胎儿中存在唐氏综合征。或者，参比序列可以是以已知或不变的数量掺入样品中并且与靶序列不同的一种序列。该方法会给出指示只相对于外部掺入的参比序列的量的靶序列的量的结果，但可用于样品之间样品内部的另一条参比序列的水平之间的归一化。如本领域所通常知道的，所使用的内标序列对于测定和校正扩增效率的差异是特别有用的。探针用于本文所述方法的探针指 单链扩增的靶和参比模板或互补物，取决于哪一组供进一步研究。这些探针可以是正确的PCR扩增拷贝或原始序列的互补物，或在最初的PCR 步骤过程中它们可以具有导入的修饰。靶探针应相应于来源于靶序列的、在研究中的序列。 参比探针应相应于来源于参比序列的、在研究中的序列。结合配偶体在每种情况下，探针还应会包含在一定条件下容许靶和参比探针物理配对的区域或部分。
该容许物理配对的区域或部分(称为“结合配偶体部分”)包含了一条探针(在一定条件下)与结合另一条核酸序列的探针特异性结合的用意。该靶探针与参比探针结合的能力使得“除去”或掩蔽比例数量的靶和参比探针成为可能。该“除去”使指示一条序列相对于核酸样品中另一条序列的量的差异的非配对的靶或参比序列的检测成为可能。在一个优选的方面，通过将相应的特异性结合配偶体对的成员分别掺入靶和参比探针中，制备供参比探针与靶探针结合的区域或部分。结合配偶体可通过例如杂交(涉及氢键)、蛋白相互作用、共价键合、离子键合、范德华相互作用以及疏水相互作用而相互作用。结合配偶体必须以明确的化学计量彼此结合。这不是说结合配偶体就得以1 1化学计量结合。而是，重 要的在于要知道化学计量。例如，抗生物素蛋白与生物素的结合具有至多8 1的化学计量。然而，实际上观察到的生物素抗生物素蛋白化学计量可随附加的核酸序列所致的空间位阻的影响而改变。但是，对于给定的生物素标记的探针，抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合的化学计量应该保持不变。用于本文所述方法的结合配偶体优选能有条件地彼此结合。“能有条件地彼此结合”意指可操纵一个配偶体与另一个的结合，使得当希望出现时只出现可检测的结合。可通过例如改变环境的温度、盐或某些其他物理或化学参数操纵条件状况。例如，对于核酸结合对，使溶液温度低于的Tm，让该结合对能彼此结合。还可通过容易地“可去除的”竞争者竞争结合位点而实现有条件的结合。“可去除的”竞争者意指与探针彼此结合相竞争，但当期望容许探针彼此结合时可物理去除或使之成为惰性的分子。还可通过添加引起结合的催化剂实现有条件的结合。例如，包含卤代核苷的互补序列暴露于UV可引起序列共价交联。化学交联剂也是本领域技术人员所已知的。在一个实施方案中，结合配偶体为相应探针所包含的基本上互补的核酸序列。在该方面，在给定的一组条件下，一条探针上的结合配偶体核酸序列能与另一条探针上的结合配偶体核酸序列杂交。对于那些在设计PCR引物序列中所考虑的类似的参数，在设计包括在本文所述的探针上的结合配偶体核酸序列时要考虑在内。例如，本领域技术人员会考虑到长度和G+C 含量对结合配偶体序列杂交行为的影响。通常，尽管并不一定，与结合参比或靶序列的探针的部分相比，利用核酸作为结合配偶体的探针的结合配偶体序列的长度与之相等或更短 (如短至少一个核苷酸或更多)。结合配偶体可择一地为任何相容于核酸杂交所需环境的特异性结合对的相应成员。换句话说，结合配偶体部分还可通过除杂交之外的方式相互作用。例如，结合配偶体部分可以是一对通过共价或非共价相互作用而彼此结合的部分。这样的结合配偶体部分的例子包括但不限于生物素_抗生物素蛋白链菌素、生物素-抗生物素蛋白、受体_配体对、异二聚化基序对(如互补的亮氨酸拉链基序、互补的螺旋-环-螺旋基序等)、抗原_抗体相互作用、适体_配体相互作用或多成分化学反应。用于连接非核酸结合配偶体与探针的方法是本领域众所周知的。此外，本领域技术人员能容易地确定核酸杂交所需要的环境对结合配偶体部分或它们彼此结合的能力是否具有不利效应。结合配偶体部分还可间接地通过“衔接分子”相互作用。如本文所使用的，衔接分子是任何一种能特异性结合结合配偶体部分，由此桥接参比和靶探针序列的分子。在一个实施方案中，衔接分子包含能与第一和第二探针的核酸结合配偶体部分杂交的核酸序列。衔接分子可以是单链、双链或具有一个或多个突出端的双链。作为衔接分子的一个非限制性例子，可以使用具有两个不同的单链突出端的双链核酸-一个突出端应基本上与靶探针上的结合配偶体序列互补，另一个突出端则应基本上与参比探针上的结合配偶体序列互补。衔接分子还可包含多个核酸。当使用衔接分子时，优选与结合配偶体部分相互作用的位点能区别第一和第二探针的结合配偶体部分。还优选第一和第二探针与能与之相互作用的各自衔接分子的比率为规定数目。在一个实施方案中，衔接分子能在1 1的比率下结合第一和第二探针。衔接分子在1 1的比率下与第一和第二探针相互作用并不是必要的。在可选的实施方案中，单个衔接分子能结合多个拷贝(如2、3、4、5、6、7、8个等)的第一和第二探针。 例如，衔接分子可包含含有多个第一和第二探针能与之特异性相互作用的位点的固体支持物。作为非限制性的例子，第一探针的结合配偶体部分可由聚腺苷酸尾组成，而第二探针的结合配偶体部分则可由聚胞苷酸尾组成。衔接分子可包含固体支持物，例如包含多个聚胸苷酸(poly-Τ)和聚鸟苷酸(poly-G)寡核苷酸的珠子，第一和第二探针能分别通过它们的结合配偶体部分与之特异性相互作用。在另一个可选的实施方案中，可使用多于1个(如 2、3、4、5、6、7、8个等)的衔接分子。靶参比探针复合物的掩蔽和去除
本文所述方法利用了参比探针和靶探针之间所形成的复合物。为了在探针彼此结合后检测非复合的或“剩余”探针分子，去除、“隐藏”或掩蔽靶参比探针复合物可能是有益的。有几种方法可以用来实现这样的去除、“隐藏”或掩蔽。一种方法是在检测中“隐藏”靶参比探针复合物。可通过以干扰检测方法的方式永久性交联靶参比探针来实现该方法。例如，如果PCR用于检测不成对探针，则靶和参比探针上的互补序列可用于结合它们，并且可通过诸如UV、丝裂霉素C或其他先前描述的化学或物理方法交联该双链体。如果用于检测的引物被设计与永久性交联位点交迭或可见于该交联位点的对侧，则成对探针的PCR扩增会被阻止，由此仅不成对探针得到扩增和检测。导入卤代核苷(如向PCR引物或破坏序列中导入)可改善U. V.交联效率(参见 Qiagen网站)。其他对核苷或核苷酸有用的化学修饰包括，作为非限制性的例子，硫醇化、 酰胺化和生物素化。如果需要的话，在反应中多于1条(如2、3、4或更多条)的引物可以被修饰。包括对不同引物的不同修饰。还可使用化学交联剂，例如丝裂霉素C(Bizanek 等 Biochemistry 1992，31，3084-3091)或其衍生物、一氧化氮(Caulfield 等 Chem Res Toxicology, 16(5) :571_574，2003)、吡咯 / 咪唑 CPI 缀合物(Bando 等，J.Am. Chem. Soc, 2003，125，3471-3485)、嗜癌霉素、比折来新(bizelesin)、氮芥、纺锤菌素或这些的衍生物。 如上所述，交联的杂交体并非用于通过例如PCR检测的有效模板。因此，只有在非交联的模板序列情况下，利用扩增靶和/或参比探针或序列的引物的PCR才会产生扩增产物。如本文所讨论的，对于最终的检测方法，扩增引物应当如此设计使得它们会与变成交联的探针上的区域杂交或使得扩增序列会含有该交联区域，由此阻止了 PCR链延伸。在交联的探针的存在会干扰PCR扩增的任何情况下，通过这些方法因此PCR的读出结果会相应于未交联的序列。检测不成对探针在靶和参比探针与所存在的靶序列的量按比例物理配对后，本文所述方法需要检测不成对探针。可通过几种不同的方法之一来进行该检测。一种检测不成对探针的方法利用了可以用来作为扩增模板的探针分子的聚合酶链反应(PCR)扩增。PCR在本领域中是众所周知的，在引物退火、引物延伸和以产生按指数增加数量的模板序列的复制拷贝的链分离循环中使用了热稳定模板依赖性聚合酶和退火至对侧链上模板核酸的寡核苷酸引物。参见例如，Mullis等，U. S.专利号4，683，202。可通过使用扩增不成对探针序列的PCR引物进行不成对探针的PCR检测。可设计 PCR引物以便利用不成对探针的特性。例如，当靶和参比探针通过互补序列标记杂交而彼此结合时，用于不成对探针扩增的引物之一可设计为与序列标记互补。例如，如果在互补序列标记杂交后靶和参比探针彼此交联，则该交联分子的标记无法用于扩增结合的引 物，使用与标记杂交的引物会将交联的探针排除在扩增之外。这样的方法仅会让不成对探针用于扩增和随后的检测。可通过任何常用于检测PCR产物的方法，检测表现出不成对探针的PCR产物以及靶核酸量的差异。例如，PCR可掺入荧光或放射性同位素标记的核苷酸或引物，那么荧光或同位素检测就可用于获取读出结果。或者，可以使用诸如TaqMan 和分子信标法或有关的方法的实时方法。在TaqMan测定(参见如U. S.专利5，723，591)中，两条PCR引物侧接中间的探针寡核苷酸。该探针寡核苷酸包含两个荧光部分。在PCR过程的聚合步骤期间，聚合酶切割探针寡核苷酸。该切割使两个荧光部分变成物理上分离的，导致荧光发射波长的改变。当更多的PCR产物形成时，新波长的强度增加了。分子信标(参见U. S.专利号 6，277，607 ；6，150，097 ；6，037，130)是一种 TaqMan 的备选方法。刚一结合互补模板，分子信标就经受了构象改变。信标的构象改变增加了信标上荧光团部分和淬灭剂部分之间的物理距离。该物理距离的增加导致淬灭剂效应减少， 由此增加了来自于荧光团的信号。还可使用其他可适用的荧光和酶PCR技术，例如Scorpions (Solinas等，2001， Nucleic Acids Res. 29 :e96)、Sunrise 引物(Nazarenko 等，1997，Nucleic Acids Res.， 25,2516-2521)和 DNA 酶(DNAzymes)。还可利用用于快速检测的毛细管电泳进行基于PCR的不成对探针检测。一般而言，当使用毛细管电泳时，序列的扩增掺入了荧光核苷酸或引物，其随后作为通过毛细管的样品被检测。如果来自不成对探针的信号是足够可靠的信号，则还可以使用无需PCR扩增的毛细管电泳。或者，可使用选择性结合不成对探针的荧光标记或荧光标记“坞(dockers)”。荧光标记“坞(dockers) ”意指在检测中能直接或通过衔接分子帮助结合预定数量的荧光标记的实体。又一种方法是添加能直接或通过衔接分子为不成对探针选择性激活的无活性的酶。然后可通过颜色、荧光或类似的读出结果的改变测定酶活性。其他检测方法可包括放射性标记及其他方法。染饩体异常和疾病在本文所述方法中，靶对参比基因背离于1 1比率表明可能的染色体异常。与疾病有关并且可使用根据本文所述方法的方法进行评估的染色体异常的非限制性例子提供于下表1中。
权利要求
1.一种测定样品中靶核酸和参比核酸哪一种以更多量存在的方法，包括(a)通过使用靶的正向引物和反向引物以及参比的正向引物和反向引物的聚合酶链反应扩增靶和参比核酸，其中参比的反向引物包含与靶序列的一部分相同的尾部序列；(b)添加与靶的反向引物互补的第一破坏序列，并添加与参比的反向引物的一部分但非尾部序列互补的第二破坏序列；和(c)检测单链靶或参比的存在，其中单链靶的存在表明更多量的靶存在于原始样品中， 而单链参比的存在则表明更多量的参比存在于原始样品中。
2.权利要求1的方法，其中该方法进一步包括，在添加第一和第二破坏序列后，但在检测步骤前使靶的反向引物退火至靶的互补物；使参比的反向引物退火至参比的互补物；和使参比的反向引物的尾部序列退火至靶；以及延伸靶和参比的反向引物以及参比的反向引物的尾部序列；其中靶的互补物、参比的互补物以及靶的至少一部分和参比的至少一部分各自转变为双链产物，而任何过量的靶或参比则仍保持单链。
3.权利要求2的方法，其中双链核酸包含卤代核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中在添加第一和第二破坏序列后，但在检测步骤前，交联双链核酸。
5.权利要求4的方法，其中使用紫外线进行交联。
6.权利要求4的方法，其中使用化学交联剂进行交联。
7.权利要求6的方法，其中化学交联剂选自丝裂霉素、嗜癌霉素、比折来新、氮芥、纺锤菌素以及它们的衍生物。
8.权利要求1的方法，其中利用聚合酶链反应进行检测步骤。
9.权利要求1的方法，其中利用荧光、毛细管电泳、放射性或酶活性进行检测步骤。
10.权利要求1的方法，其中样品为生物样品。
11.权利要求10的方法，其中生物样品选自血液、血清、血浆、活检标本、拭子、涂片、细胞培养物、RNA和cDNA。
12.权利要求1的方法，其中样品不是生物样品。
13.权利要求10的方法，其中样品获得自孕妇。
14.权利要求13的方法，其中靶或参比核酸序列是胎儿核酸序列。
15.权利要求14的方法，其中靶和参比核酸序列的量之间的差异与胎儿中的染色体异常有关。
16.权利要求15的方法，其中差异与胎儿中的唐氏综合征有关。
17.权利要求15的方法，其中差异与胎儿中的特纳综合征、爱德华综合征、帕韬综合征、克兰费尔特综合征、X三体综合征或XYY综合征有关。
18.权利要求1的方法，其中靶和参比核酸序列的量之间的差异与非整倍性有关。
19.权利要求18的方法，其中非整倍性与癌症有关。
全文摘要
本发明涉及核酸检测。具体地，本发明提供了用于样品中核酸数量检测的方法。所述方法利用了破坏和对PCR方向进行重新定向的能力，以及物理配对具有参比序列的样品中的核酸分子和具有靶序列的样品中的核酸分子的能力。PCR反应的重新定向使得作为其他技术预备步骤的部分扩增在同一个试管中得以进行。该配对可产生指示靶序列相对于参比序列的量的差异的未配对的靶或参比序列。在诊断和研究应用中，该方法被广泛地应用于检测核酸的量的差异。
文档编号C12Q1/68GK102344959SQ201110225308
公开日2012年2月8日 申请日期2006年3月23日 优先权日2005年3月24日
发明者N·萨什 申请人:佐拉根生物科技有限责任公司