专利名称：丙烯酰赖氨酸翻译系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO :2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明还涉及一种丙烯酰赖氨酸(Acryllysine,或AcrK)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶和它们的配对将丙烯酰赖氨酸掺入目标蛋白质的丙烯酰赖氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异掺入丙烯酰赖氨酸的遗传方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种遗传方法产生的含有丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质，以及含有丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的应用。
背景技术：
蛋白质是细胞功能的主要执行者。许多重要的生命过程，如多亚单位蛋白质复合体形成、细胞内信号转导、基因转录、蛋白质转运、蛋白质修饰和降解等，都依赖于蛋白质之 间相互作用。所以，研究蛋白质的结构、功能及其相互作用是理解细胞生命过程中各种内在机制的关键。蛋白荧光标记技术已经被广泛应用于蛋白质功能的可视化研究中。荧光蛋白常被用来研究蛋白质在生物体内的表达和定位，但由于它本身体积比较大，往往会影响目标蛋白的生物活性。特异性的小分子荧光探针以其体积小、膜透性好、背景噪音低以及制备方便的优点成为蛋白质研究的一个有力工具(陈磊，姚祝军，生命科学，2008，20 (I)3-12)。但是，如何将具有各种不同功能的荧光分子引入到特定的蛋白是限制其应用的瓶颈。因此，发展一种高效的蛋白标记技术对生命科学的研究有着重要的意义。为此，生物正交化学提供了令人兴奋的研究生物体中生物分子动力学及功能的新策略(Prescher J. A. , Bertozzi C. R. Nat. Chem. Biol. , 2005,1 :13-21 ；van Swieten P. F.,Leeuwenburgh M. A. , Kessler B. Μ. , Overkleeft H. S. Org. Biomol. Chem. ,2005,3 :20-27 ；Barglow K. Τ. , Cravatt B. F. Nat. Methods，2007，4 :822-827)。与以配体为基础的方法相t匕，生物正交化学则需要能与目标生物分子特异性共价结合的探针分子。因此这种方法具有以下独特的优势(I)能应用到各种各样的生物体分子中，包括蛋白、核酸、碳水化合物和脂质体。(2)用途广泛，探针分子的选择取决于研究人员的想象力。(3)具有高扩展性，适合活细胞中单个目标生物分子功能注释以及一类生物分子的全基因功能分析。由于这些特征，生物正交化学被成功的运用到可视化蛋白表达，跟踪蛋白定位，测定蛋白活性，鉴定蛋白相互作用和生物体系中蛋白转换等功能研究。在化学和生物学复杂的分子系统研究中，需要高度选择性修饰分子的方法。特别是在大生物分子中，由于分子链长和结构复杂，不可避免的产生非特异性标记和副反应。通过生物正交化学的方法选择性的修饰蛋白为研究活体内蛋白功能提供了强有力的工具，这种方法目前的一个主要瓶颈是缺少可以位点特异性插入蛋白的生物正交反应基团。另外，生物正交反应广泛应用于解决生物体中复杂和动态的生物问题上则应具备以下三种必要特性(I)真正的生物正交性；(2)快反应速率；(3)快速的可诱导性(LIM Reyna K. V. ,LINQ. Science china, 2010, 53 (I) :61-70)。优良的生物正交性和快反应速率的重要性在这个领域中已经得到认可，但可诱导性的重要性还没有被广泛理解。
与其他生物正交反应相比，点击化学由于其具有高选择性、水兼容性和高产率的特点使其在细胞生物学研究中具有巨大的应用前景(Y. Clovis J. S. , EckellA., HuisgenR.，Sustmann R. Chem. Ber.，1967,100 :60_70)。光点击化学是由纽约大学的 Lin Q.教授提出来的概念，其的主要优点是不需要Cu (I)催化，而是通过光诱导引发反应。这类生物正交反应提供了一种用于研究生物时空分辨和可控引发的化学工具。由于四唑类化合物在紫外光照射下能够释放氮气而原位生成腈亚胺偶极子，该偶极子与烯发生瞬间环合生成吡唑啉环加成产物(Wang Y. ,Rivera Vera C. I. ,Lin Q. Org. Lett. ,2007,9 :4155_4158 ； Wang Y.，Hu ff. J.，Song ff.，Lim R. K. V.，Lin Q. Org. Lett.，2008，10 :3725_3728)，因此这类反应能够实现时空可控引发。值得注意的是这种环加成反应具有以下特点(I)与传统的利用半胱氨酸和氮端氨基或碳端羧基的反应活性引入标记分子的蛋白标记方法相比，基因编码含有烯烃官能团的氨基酸具有位点特异性。(2)四唑类化合物在光照条件下只与烯烃反应，具有反应特异性，能够实现蛋白的特异标记。(3)能够在多种溶剂中发生反应，具有良好的溶剂兼容性；能够特定的与烯烃反应，而不与醛基，氰基等活性基团反应，具有官能团耐受性；立体选择性和高收率(90%以上)。(4)反应快速，腈亚胺偶极子的生成速率为Ii1 = O. 14s—1，环合产物的二级反应速率为11. OM4S'而且吡唑啉环加成产物是有荧光的，这样我们就能用突光分析来证明特定的环加成产物的生成(Song, ff. , Wang, Y. , Qu, J., Madden, Μ. Μ.，Lin, Q. Angew. Chem. Int. Ed.，2008,47 :2832_2835)。随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，光学成像的分辨率得到极大的改进，超分辨和活细胞荧光成像成为目前生物单分子研究的热点。2006年底，庄晓薇实验组开发出来一种打破分辨率极限的 STORM 超高分辨荧光成像采技术(Rust M. J.，Bates Μ.，Zhuang X. Nat. Methods, 2006, 3 793-795)。他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换。当Cy3和Cy5交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性。 将Cy3和Cy5分子对交联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白。应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像。2007年，他们进一步改进STORM技术，发展了不同颜色的变色荧光分子对，可以同时记录两种甚至多种蛋白质的空间相对定位，从而阐明笼形蛋白clathrin(网格蛋白)形成的内吞小泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位直关系，两种颜色的分辨率都可以达到20 30nm(Bates Μ. ,Huang B.，Dempsey G. T.，et al. Science, 2007, 317 1749-1753) 因此，我们希望通过扩展基因密码的方法在蛋白的特异性位点掺入含有烯烃官能团的氨基酸，利用烯烃与连有染料分子的四唑化合物在一定波长紫外光照射下发生环加成反应来交联荧光分子，从而建立位点特异性标记蛋白和超高分辨荧光成像的一种新方法，为将来的深入研究创造条件。
为了能在蛋白的特异性位点掺入含有烯烃官能团的氨基酸，本领域需要能将非天然丙烯酰赖氨酸掺入蛋白质的新方案。现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地掺入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸掺入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该Ο-tRNA。这些组分不与宿主生物4体内的任何内源性tRNA、氨酰tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其名为“METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASE PAIRS ” ；TO 2002/085923，其名为 “ IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS” ;TO 2004/094593，其名为 “EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。掺入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz, Chem. Commun. (Camb) I :1-11(2002) ;Wang和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed. 44(1) :34-66(2005) ;Xie 和 Schultz，Methods36 (3) :227-238(2005) ;Xie 和 Schultz，Curr. Opinion in Chemical Biology9(6) :548-554(2005) ;Wang 等，Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct. 35 :225-249(2006)。
发明内容
I、技术问题本发明提供丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO :2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明涉及利用正交tRNA、正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶和它们的配对将丙烯酰赖氨酸(AcrK)掺入目标蛋白质的丙烯酰赖氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性掺入丙烯酰赖氨酸的遗传方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种遗传方法产生的含有丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质及其应用。因此，本发明的目的在于提供利用正交tRNA、正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶和它们的配对将丙烯酰赖氨酸掺入蛋白质的丙烯酰赖氨酸翻译系统，并且提供利用该翻译系统在目标蛋白质中掺入丙烯酰赖氨酸的方法。本发明还提供利用本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统产生的含有至少一个丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质。在本发明的优选方面中，本发明人利用这种方法将丙烯酰赖氨酸分别定点特异掺入绿色突光蛋白(GFP)和Ftsz蛋白(filamentation temperaturesensitive Z ring,Peter L. Graumann, Annu. Rev. Microbiol. ,2007,61 :589-618)中，通过与四唑类化合物发生光点击反应生成具有荧光的化合物进而实现荧光标记。然而，本领域技术人员应该理解，本发明的方法也可以用于在绿色荧光蛋白(GFP)和Ftsz蛋白之外的多种蛋白中定点特异掺入丙烯酰赖氨酸，并不局限于这两种蛋白。在另一个方面中，本发明提供利用本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统获得的在至少一个所选位置定点特异掺入丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的应用，所述突变蛋白质中的丙烯酰赖氨酸在光引发下通过与含有四唑官能团的化合物特异反应，从而交联化学活性荧光基团，用于在体内或体外有效地标记蛋白，或用于活体细胞成像，例如，用于真细菌细胞、或哺乳动物细胞的活体细胞成像。2、技术方案本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)对选择密码子(selector codon)如琥珀终止密码子(TAG)起反应而将非天然氨基酸丙烯酰赖氨酸掺入延伸中的多肽链的丙烯酰赖氨酸翻译系统。所述丙烯酰赖氨酸翻译系统包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA(Ο-tRNA)和正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)配对。即，宿主细胞内源性氨酰tRNA 合成酶不会用氨基酸(天然的或非天然的)加载Ο-tRNA。类似地，本发明提供的O-RS不以显著水平或者某些情况下不以可检测水平地用氨基酸(天然的或非天然的)加载内源性 tRNA。利用所述翻译系统能够产生含有在翻译过程中掺入丙烯酰赖氨酸的大量蛋白质。
在一些方面中，本发明提供丙烯酰赖氨酸翻译系统。所述翻译系统包含(a)非天然氨基酸，即丙烯酰赖氨酸，(b)正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(O-RS)，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO :2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组和(c)正交 tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID NO : I所示的多核苷酸序列，其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰 tRNA合成酶用所述非天然氨基酸(即丙烯酰赖氨酸)，优先氨酰化所述0-tRNA。
优选地，本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有由正交tRNA (Ο-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子，优选地为琥珀密码子。更优选地，本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统还包含编码所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰 tRNA合成酶的核苷酸序列。
在本发明的优选方面中，本发明提供一种丙烯酰赖氨酸翻译系统，所述系统包含
(i)丙烯酰赖氨酸；
(ii)正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO 2所示氨基酸 和它们的保守性变体构成的组；
(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO :1所示的多核苷酸序列；其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶用所述丙烯酰赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和
(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
优选地，所述丙烯酰赖氨酸翻译系统还包含编码所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA 合成酶的核苷酸序列。
该翻译系统中的各种组分可以衍生自各种物种来源，例如，该翻译系统中的各组分衍生自巴氏甲烧八叠球菌(Methanosarcina barkeri)。例如，正交tRNA(Ο-tRNA)为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的赖氨酸tRNA。在一些实施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些实施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO :1所示的多核苷酸序列，优选地，Ο-tRNA的序列如SEQ ID N0:1所示。在一个实施方式中，用于该系统的正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(O-RS)包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，优选地，所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(O-RS)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
在一些方面中，本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统还包含编码目标蛋白质的核酸， 其中所述核酸具有由正交tRNA (Ο-tRNA)特异性识别的至少一个选择密码子。在优选方面中，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
在一些方面中，本发明提供包含正交tRNA序列和编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰 tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。所用的宿主细胞不作具体限定，只要O-RS和0-tRNA 在它们的宿主细胞环境中保留它们的正交性即可。例如，所述宿主细胞可以是真细菌细胞， 也可以是哺乳动物细胞，优选大肠杆菌细胞和中国仓鼠卵巢细胞。如实施例所述，可以将包含正交tRNA序列的重组载体和包含编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重组载体共转化到宿主细胞中，而获得包含正交tRNA序列和编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞。本发明还提供产生在至少一个所选位置定点特异性掺入丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的遗传方法。所述方法利用上述丙烯酰赖氨酸翻译系统进行。所述方法通常始于提供含有以下组分的丙烯酰赖氨酸翻译系统的步骤(i)非天然氨基酸，即丙烯酰赖氨酸；( )正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(O-RS)，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO 2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组；(iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ IDNO 1所示的多核苷酸序列，其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶 用所述非天然氨基酸(即丙烯酰赖氨酸)优先氨酰化所述正交tRNA;和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到包含正交tRNA序列和编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞中，在所述蛋白质的翻译过程中，丙烯酰赖氨酸氨酰化的Ο-tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的丙烯酰赖氨酸掺入所述目标蛋白质的所选位置，从而产生在所选位置含有丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质。其中包含正交tRNA序列和编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的宿主细胞可以通过将包含正交tRNA序列的重组载体和包含编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列的重组载体共转化到所选的宿主细胞中而获得。本领域技术人员应该理解，这可以通过常规分子克隆技术和筛选技术实现。在所述方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱变使野生型氨酰tRNA合成酶的氨基酸结合口袋发生突变，选择用所述非天然氨基酸(即丙烯酰赖氨酸)优先氨酰化所述Ο-tRNA的氨酰tRNA合成酶突变体(S卩，本发明所用的正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶)。在一些实施方式中，提供翻译系统的步骤还包括提供Ο-tRNA的序列，Ο-tRNA为古菌来源的反密码子突变为与琥珀密码互补的赖氨酸tRNA，例如，所述Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO : I所示的多核苷酸序列。在这些方法中，提供翻译系统的步骤还包括提供含有所述翻译系统所用的琥珀选择密码子的编码目标蛋白质的核酸。还可在宿主细胞内实施产生含有丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的方法。在这些情况中，提供的宿主细胞包含本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统(即，包含编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(O-RS)的核苷酸序列、正交tRNA (Ο-tRNA)序列和含有至少一个选择密码子的编码目标蛋白质的核酸)，而在适宜的培养条件下(例如，在培养基中添加适宜浓度的丙烯酰赖氨酸等)培养该宿主细胞可导致在所述目标蛋白质中定点特异性掺入丙烯酰赖氨酸。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞和哺乳动物细胞，例如，大肠杆菌和中国仓鼠卵巢细胞。本发明还提供蛋白荧光标记的遗传方法，所述方法利用上述丙烯酰赖氨酸翻译系统进行。这些方法通常始于提供含有以下组分的丙烯酰赖氨酸翻译系统的步骤(i)丙烯酰赖氨酸；(ii)正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(O-RS)，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO :2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组；(iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其包含SEQ ID N0:1所示的多核苷酸序列，其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶用所述丙烯酰赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和(iv)编码所述荧光蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子(任选地为琥珀密码子)；然后在所述蛋白质的翻译过程中，丙烯酰赖氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的所述丙烯酰赖氨酸掺入所述蛋白的所选位置，之后通过与含四唑官能团的化合物在一定波长紫外光照射下发生环加成反应，生成具有荧光的吡唑化合物以实现位点特异性标记蛋白和超高分辨荧光成像。
因此，本发明还提供利用本发明的丙烯酰赖氨酸翻译系统获得的包含至少一个丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的应用，所述突变蛋白质中的丙烯酰赖氨酸在光引发下通过与含有四唑官能团的化合物特异反应，从而交联化学活性荧光基团，用于在体内或体外有效地标记蛋白，或用于活体细胞成像。所述活体细胞选自真细菌细胞，或哺乳动物细胞，优选大肠杆菌细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
3、有益效果
通过生物正交化学的方法选择性的修饰蛋白，可以实现蛋白位点特异性插入生物正交反应基团。应用琥珀密码子在细胞中编码含有烯烃活性官能团的氨基酸(丙烯酰赖氨酸)，实现在特定位点掺入该非天然氨基酸的蛋白质的高效表达，进而在光引发下通过与含有四唑官能团的化合物特异反应，从而交联化学活性荧光基团。并且丙烯酰赖氨酸与四唑类化合物的光点击反应速率很快，365nm紫外线照射下，只需几分钟，就可以在体内或者体外有效地标记蛋白，从而实现蛋白特异位点突光标记。
另外，采用遗传突变掺入丙烯酰赖氨酸以及光点击反应技术，还适合活体细胞成像，无需基因融合绿色荧光蛋白(GFP)。因为该方法比较简单，仅需要突变一个氨基酸，同时附加使用一个分子量338Da的四唑类化合物T3即可在干扰背景最低的情况下实现活体细胞中的蛋白质成像。该成像技术对于标记那些可以组装成分子量较大的复合体的蛋白，如细胞骨架或鞭毛尤其有意义。因为引入GFP融合或其他大的标签可能干扰标记蛋白的装配和功能。
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，
其中
图I是丙烯酰赖氨酸的合成；
图2是四唑类化合物Tl及T3的合成；
图3是文中所述蛋白的核苷酸/氨基酸序列；
图4 :a图是AcrK-绿色荧光蛋白(GFP)的SDS-PAGE电泳图，b图(上)是质谱图解卷积处理图，b图(下)是电喷雾质谱图5 :a图是野生型Ftsz蛋白及Ftsz_3_AcrK蛋白和T3进行光点击反应后的 SDS-PAGE及琼脂糖凝胶电泳图，b图是野生型Ftsz蛋白及Ftsz-3-AcrK蛋白和T3进行不同时间(0-10分钟)光点击反应后的SDS-PAGE及琼脂糖凝胶电泳图，c图是产生野生型Ftsz 蛋白及Ftsz-3-AcrK蛋白的大肠杆菌细胞和T3进行不同时间(0_20分钟)光点击反应后， 细胞裂解液的SDS-PAGE及琼脂糖凝胶电泳图6是大肠杆菌细胞荧光成像左图是通过DAPI通道观察图片，右图是通过DIC通道观察图片；图7是CHO细胞荧光成像左图是通过GFP通道观察图片，右图是通过DIC通道观察图片。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。本领域技术人员应该理解，除非特别说明，下述实施例中所用的化学试剂均为可通过商业途径购得的分析纯级别的试剂。实施例I :化学合成I、丙烯酰赖氨酸(AcrK)的合成(图I):向装有磁力搅拌和温度计的250mL圆底三口瓶中加入化合物N-a -Boc-赖氨酸(2. 46g, 10. Ommol，购自上海吉尔生化公司)及无水碳酸钠(2. 12g,20. Ommol)，再加入IOOmL乙酸乙酯和水的混合溶剂(乙酸乙酯水(v/v)=
I I)，冰浴搅拌下缓慢加入1.1个当量丙烯酰氯(购自TCI公司)的乙酸乙酯溶液。反应过夜，用冰醋酸调PH至3，乙酸乙酯萃取，旋蒸后冰浴下加入IOOmL乙酸乙酯的氯化氢溶液，搅拌过夜，有大量白色固体析出，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤数次，干燥后得目标化合物丙烯酰赖氨酸(I. 44g，7. 2mmol)，收率 72%。1H NMR(600MHz, D2O) δ = I. 38-1. 47 (m，2H)，
I.55-1. 59(m，2H)，I. 89-1. 97 (m，2H)，3. 26 (dd, J1 = 6. 94Hz, J2 = 13. 73，2H)，4. 03 (dd, J1=6.21Hz，J2 = 12.47Hz，2H)，5.71(d，J = 10. 30Hz, 1H) ,6. 12—6. 24 (m，2H)。ESI—MS m/z201. 1[M+H]+。2、四唑类化合物Tl的合成(图2):根据文献方法(Ito, S. ；Tanaka, Y. ；Kakehi,A. ;Kondo，K. Bull. Chem. Soc. Jpn.，1976,49 :1920-1923)，将 4-甲酸-苯甲酸甲酯(I. 64g,10. Ommol,购自Alfa Aesar公司)溶于IOOmL无水乙醇中，加入和等当量的苯磺酰肼(I. 72g，10. Ommol，购自百灵威公司)，使反应在室温下搅拌过夜，有大量白色固体析出。过滤，收集固体干燥后得2. 92g，收率92%，不需进一步提纯而直接用于下一步反应。将对甲氧基苯胺(615mg, 5. Ommol,购自百灵威公司)溶于无水乙醇水(I : 1，IOmL)中，冰浴冷却后加入浓盐酸(I. OmL)搅拌IOmin后，缓慢滴加NaNO2 (363mg，5. 25mmol)的5mL水溶液。冰浴下继续搅拌Ih后，将其滴加到上述合成的Schiff碱(I. 59g，5. Ommol)的20mL吡啶溶液中。TLC跟踪反应进程，反应结束后，加入等体积的水后有大量固体析出，过滤，用乙醚和乙酸乙酯的混合溶剂(I I)洗涤后得到浅粉色固体，收率为52%。1HNMR (600MHz, CDCl3) δ = 3. 98(s，3H)，4· 05(s，3H)，7· 15 (d, J = 8. 1Ηζ，2Η)，8· 18 (d, J =8. 1Ηζ，2Η)，8· 27 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 39 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η) ；13C NMR(150MHz，CDCl3) δ =52. 25,55. 64,114. 72，121. 40，126. 85，130. 15，130. 31,131. 37，131. 70，160. 68，164. 07，166.46。3、四唑类化合物Τ3的合成(图2):将合成的化合物Tl(310mg，1.0mmol)悬浮于乙二胺(购自北京市兴沣化工厂)中，加热至80°C过夜。减压浓缩，用甲醇二氯甲烷(v/v) = I 9体系过柱(100目硅胶柱(购自蓝弋公司))，纯化后得浅黄色固体200mg，收率为 60%。1H NMR(600MHz，DMS0-d6) δ = 3· 04 (s，2Η)，3· 60-3. 57 (m，2Η)，3· 88 (s，3Η)，7. 24 (d, J = 13. 2Hz,2H) ,7. 95 (br s，2H)，8. 09-8. 11 (m，4H)，8. 28 (d，J = 12. 0Hz,2H),8. 84(t, J1 = 7. 8Hz, J2 = 16. 2Hz, 1H) ；13C NMR(150MHz，DMS0_d6) δ = 37. 23,38. 58,55. 70, 115. 11，121. 69，126. 42，128. 36，129. 08，129. 52，135. 91，160. 48，163. 63，166. 20 ;ESI_MS m/z 339. 1[M+H]+。
以上合成反应所需化学试剂如无特别说明，均购自北京化工厂，均为分析纯以上级别。
实施例2 :表达AcrK-绿色荧光蛋白(GFP)及质谱鉴定
为了在基因中位点特异性掺入丙烯酰赖氨酸(AcrK)，需要在所用的E. coli宿主细胞中引入丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，这个正交对来源于巴氏甲烧八叠球菌(Methanosarcina barkeri)玻拍抑制 tRNA (Mb tRNAo^1) / 氨酸 tRNA 合成酶(Mb PylRS)对。将正交tRNA (SEQ ID NO : I)和丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体 (SEQ ID NO 2) (Heinz Neumann,Sew Y Peak-Chew,Jason ff Chin,Genetically encoding Ne-acetyllysine in recombinant proteins, Nature chemical biology,4,4,2008 ； Neumann H, Hancock SM, Buning R，et al，Mol Cell, 2009 0ct9 ；36(1) 153-63)分别构建到pEVOL载体(美国scripps研究所Peter G. Schultz实 验室惠赠)上，然后共转化到包含有 pEt22b-GFP-151TAG(SEQID NO 4) (pEt22b 购自 novagen 公司)的 DH10B 细胞(购自全式金公司)中。挑取单个克隆在37°C培养到0D_约等于0. 5时，向LB培养基中加入ImM 丙烯酰赖氨酸(AcrK), ImM IPTG (购自sigma公司)及0. 2 %阿拉伯糖(购自sigma公司) 培养细胞，对照不加入AcrK。6-8小时之后，收菌，Ni-NTA(购自南京金斯瑞公司)纯化蛋白，并用SDS-PAGE电泳分析(图4a)。
我们发现，只有在存在丙烯酰赖氨酸(AcrK)的培养基中才能纯化出全长的绿色荧光蛋白，这说明丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体可以特异性的识别AcrK。在LB培养基中，AcrK-绿色荧光蛋白的产率为10mg/L，而野生型绿色荧光蛋白的产率为50mg/L。为了检测AcrK仅仅掺入到绿色荧光蛋白的151位琥珀突变位点，我们对AcrK-绿色荧光蛋白进行了 ESI-TOF质谱检测，检测结果分子量为27728Da (图4b)，与计算的分子量27728Da吻合，说明该丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体可以有效地将丙烯酰赖氨酸掺入到目标蛋白的琥珀突变位点。
实施例3 :表达AcrK-Ftsz并进行体内外光点击反应
将野生型Ftsz (SEQ ID NO :6，来源于大肠杆菌BL21)构建在pEt22b载体(购自 novagen公司)上，同时将正交tRNA (SEQ ID NO 1)和丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体的核苷酸序列(SEQ ID N03)分别构建到pEVOL载体(美国scripps研究所Peter G. Schultz实验室惠赠)上。通过PCR方法，在Ftsz 3位引入TAG(SEQ ID NO :8，Ftsz_3TAG， 其中第3位氨基酸为丙烯酰赖氨酸，用@表示)。共转化pEVOL-tRNA (即，包含正交tRNA序列(SEQ ID NO: I)的重组载体)，pEV0L_AcrKRS (即，包含丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶突变体核苷酸序列(SEQ ID NO 3)的重组载体)及pEt22b-Ftsz-3TAG到BL21(DE3)细胞(购自全式金公司)中，表达纯化条件同Ftsz-3-AcrK。结果显示,只有在存在AcrK的培养基中才能纯化出全长的Ftsz-3-AcrK蛋白，产率为5mg/L，而野生型Ftsz蛋白的产率为50mg/L。
取10 μ M纯化的野生型Ftsz蛋白及Ftsz_3_AcrK蛋白分别与100 μ M四唑类化合物Τ3在PBS缓冲液中孵育，然后用365nm手提紫外灯照射5分钟，同时以未照射紫外灯的作为对照。将反应后的混合物加入琼脂糖凝胶的加样槽内，通电进行电泳。待电泳结束后，取出凝胶，在紫外灯下观察是否有荧光。观察结果表明，只有Ftsz-3-AcrK蛋白和T3混合物在经紫外灯照射后能形成荧光产物(图5a)，也就是说，T3只能和AcrK进行光点击反应，而不能与其它天然氨基酸发生反应。为了验证该反应的速率，取如上所述Ftsz-3-AcrK蛋白和T3混合物，用365nm手提紫外灯分别照射不同时间(0_10分钟)后，通过凝胶电泳观察荧光。如图5b所示，紫外灯仅照射10秒后，就能形成肉眼可观察到荧光的环加成产物，并且随着照射时间的延长，荧光强度也逐渐增加，直至照射5分钟时，光点击反应基本结束。为了进一步证明该点击反应在活体细胞内的有效性和选择性，我们培养出分别能产生野生型Ftsz蛋白及Ftsz-3-AcrK蛋白的大肠杆菌细胞(利用常规分子克隆技术进行，分别构建野生型Ftsz蛋白及Ftsz-3-AcrK蛋白的表达载体,然后转化到大肠杆菌细胞中进行表达)，并将其与100 μ M T3在PBS缓冲液中37°C孵育30分钟，然后用365nm手提紫外灯分别照射不同时间(0-20分钟)后，裂解细胞，通过凝胶电泳和SDS-PAGE观察分析细胞 裂解液。如图5c所示，产生野生型Ftsz蛋白的大肠杆菌细胞不能与T3产生光点击反应，而产生Ftsz-3-AcrK蛋白的大肠杆菌细胞和T3仅需365nm紫外灯照射I分钟，就可以形成荧光产物。同时，我们验证了光点击反应在活体细胞荧光成像方面的应用。我们培养出分别能产生野生型Ftsz蛋白及Ftsz-3-AcrK蛋白的大肠杆菌细胞，将其与ΙΟΟμΜ T3在PBS缓冲液中37°C孵育30分钟，然后用365nm手提紫外灯分别照射5分钟后，于奥林巴斯LSCMFV500聚焦显微镜(日本，奥林巴斯)下通过DAPI通道观察荧光信号。从如图6所示，只有产生Ftsz-3-AcrK蛋白的细胞产生荧光信号，而产生野生型Ftsz蛋白的大肠杆菌细胞则无突光信号。实施例4 :表达EGFP-AcrK并进行哺乳动物细胞荧光成像既然细菌和哺乳动物细胞中均存在氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，我们接下来验证了正交tRNA/正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶(MbtRNACUAPyl/Mb AcrKRS)是否可以将AcrK遗传掺入到哺乳动物细胞蛋白中。我们把tRNAo/71 (SEQ ID NO I)和AcrKRS基因(SEQ ID NO 3)分别克隆到 pCMV-ΝΒΚ-Ι 载体(美国 scripps 研究所 Peter G. Schultz 实验室惠赠)上，分别获得重组构建体pCMV-tRNA和pCMV-AcrKRS，由CMV启动子控制AcrKRS的表达，U6控制Mb tRNACUAPyl的转录。同时按照常规分子克隆方法构建pSwan-EGFP质粒(pSwan质粒由美国scripps研究所Peter G. Schultz实验室惠赠),并在EGFP的37位引入TAG突变。在35-mm玻底皿(购自杭州生友公司)上用10% FBS DMEM/F12培养基(购自茂健联星公司)培养CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，购自中国协和医科大学基础医学院)，待其生长至50-60%时,用Lipofectamine 2000试剂(购自Invitrogen公司)将质粒pCMV-tRNA、pCMV-AcrKRS和pSwan_EGFP37TAG共转染到CHO细胞中，在加入ImM丙烯酰赖氨酸(AcrK)的情况下培养细胞48小时，并以未加AcrK的作为对照。发现只有加入AcrK的细胞可以观察到荧光信号，而没有AcrK的情况下无荧光信号(图7)，表明AcrK成功地通过Mb tRNACUAPyl/Mb AcrKRS正交对掺入到哺乳动物细胞的遗传密码子编码的蛋白序列中。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
权利要求
1.一种丙烯酰赖氨酸翻译系统，所述系统包含(i)丙烯酰赖氨酸；(ii)正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQID NO :2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组；(iii)正交tRNA，其包含SEQID NO :I所示的多核苷酸序列；其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶用所述丙烯酰赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
2.如权利要求I所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
3.如权利要求I所述的翻译系统，其还包含编码正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其包含所述正交tRNA序列和编码所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA 合成酶的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，或哺乳动物细胞， 优选大肠杆菌细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
6.一种产生在至少一个所选位置定点特异性掺入丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的遗传方法，所述方法包括下述步骤(a)提供权利要求I所述的丙烯酰赖氨酸翻译系统，该系统包含(i)丙烯酰赖氨酸；( )正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO :2所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组；(iii)正交tRNA，其包含SEQID NO :I所示的多核苷酸序列；其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶用所述丙烯酰赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和(b)将编码所述目标蛋白质的核酸转化到权利要求4所述的宿主细胞中，在所述蛋白质的翻译期间，丙烯酰赖氨酸氨酰化的正交tRNA对所述选择密码子起反应而将培养基中的丙烯酰赖氨酸掺入所述目标蛋白质的所述所选位置，从而产生在所选位置含丙烯酰赖氨酸的所述突变目标蛋白质。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子。
8.由权利要求6所述的方法获得的含有至少一个丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质。
9.由权利要求6所述的方法获得的含有至少一个丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的应用， 所述突变蛋白质中的丙烯酰赖氨酸在光引发下通过与含有四唑官能团的化合物特异反应， 从而交联化学活性荧光基团，用于在体内或体外有效地标记蛋白，或用于活体细胞成像。
10.权利要求9所述的应用，其用于真细菌细胞、或哺乳动物细胞的活体细胞成像。全文摘要
本发明提供利用正交tRNA、正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶和它们的配对将丙烯酰赖氨酸掺入目标蛋白质的丙烯酰赖氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异掺入丙烯酰赖氨酸的方法。所述丙烯酰赖氨酸翻译系统包含(i)丙烯酰赖氨酸；(ii)正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交丙烯酰赖氨酸氨酰tRNA合成酶用所述丙烯酰赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。本发明还涉及掺入丙烯酰赖氨酸的突变蛋白质的应用。
文档编号C12N15/00GK102925427SQ20111022515
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者王江云, 李发慧, 孙云, 潘延超 申请人:中国科学院生物物理研究所