专利名称：一种山梨糖还原酶在生物法制备(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种山梨糖还原酶，特别涉及该山梨糖还原酶在通过生物方法生产(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。
背景技术：
(S)-4-氯-3 羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S) -CHBE) 是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括起来主要有化学法和生物法。化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂的贵铑、釕等金属，采用化学法合成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高，污染大。生物法分为酶催化和全细胞催化法，Shimi zu等用来自Sporobolomyces salmonicoIorAKU 4429的NADPH依赖的醛基还原酶分别在单一水相体系[2]和水/有机溶剂两相体系[3]催化还原COBE制备手性CHBE，由于应用酶催化还原反应所用的酶要从微生物细胞中分离纯化得到，过程操作繁琐且酶容易失活，与全细胞催化相比，应用较少。 全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(S) — CHBE两种，Yasohara等 [4]从400株酵母菌中筛选得到了一株Omdida 卵Wiae，在水/乙酸正丁酯体系中， 在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的条件下产物(S)-CHBE在有机相的积累浓度可达90 g/L，产物的光学纯度对映体过量值(enantiomeric excess e. e)达到96%。由于采用野生酵母中往往含有多种能够催化COBE为不同构型CHBE 的还原酶，因此采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(S)-CHBE。Yasohara等[5]从木兰假丝酵母菌Candida magnoliae中分离得到了一个辅酶NADPH依赖型的羰基还原酶，将该酶与葡萄糖脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中共表达，在定时添加适量的辅酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的条件下，催化COBE的不对称还原(S) -CHBE,其得率和光学纯度分别为85%和100%e. e. [6]。综上所述，现有催化COBE为(S) -CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性底、 成本高等问题。本专利中涉及到的还原酶是山梨糖还原酶的一种，其包含281个氨基酸，其 Genbank 巾白勺 & i # 力 XP_715552. 1， (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/XP—715552. 1)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。编码该蛋白的基因含有843bp碱基 ，^^ Genbank 巾白勺力 ΕΑΚ96529. 1， (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/ EAK96529)，其基因序列如SEQ ID NO :1所示。至今未发现该山梨糖还原酶用于COBE不对称还原制备(S)-CHBE的报道。参考文献
Karanewsky DSj Badia MCj Ciosek CP Jrj Robl JFj Sofia MJj Simpkins LMj DeLange B， Harrity TWj Biller SAj Gorden EM (1990) Phosphorus-containing inhibitors of HMG-CoA reductase. 1. 4-[2-arylethyl]-hydroxyphosphinyl]-3~hy droxybutanoic acids: a new class of cell-selective inhibitors of cholesterol biosynthesis. J Med Chem 33:2925 - 2956。[2] Shimizu S， Kataoka M，Morishita A Katoh M， Morikawa Tj Miyoshi T，Yamada H (1990a) Microbial asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutaoate to optically active ethyl 4-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Biotechnol Iett 12:593一596。[3] Shimizu S，Kataoka M，Katoh M，Morikawa Tj Miyoshi T，Yamada H(1990b) Stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutaoate by a microbial aldehyde reductase in an organic solvent-water diphasic system. Appl Environ Microbiol 56: 2374-2377。[4] Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa J，Takahashi S，Wada M，Kataoka Mj Shimizu S (1999) Synthesis of opticalIy activeethyl 4-chloro_3-hydroxybutanoate by microbial reduction. Appl Microbiol Biotechnol 51:847 -851。[5] Wada M，Kataoka M，Kawabata H，Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa Jj Shimizu S (1998) Purification and characterization of NADPH-ependent carbony1 reductase involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutanoate， from Candida magnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 62:280 - 285。[6] Yasohara Y，Kizaki N，Hasegawa J，Wada M，Kataoka M，Shimizu S (2000) Molecular cloning and overexpression of the gene encoding an NADPH-dependent carbony1 reductase, involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3_oxobutanoate， from Candida magnoliae. Biosci Biotechnol Biochem 64:1430 - 1436。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种山梨糖还原酶在COBE不对称还原制备 (S)-CHBE中的应用。为解决上述技术问题，本发明所釆用的技术方案如下
一种氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的山梨糖还原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)中的应用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的山梨糖还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。具体反应是将表达基因序列如SEQ ID N0:1所示的重组菌，1.5 300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯，在ρΗ6. (Γ7. 5、2(T30°C、18(T280rpm条件下，分别与200mmol/L 2mol/L山梨醇、甘露醇、木糖醇，反应16 20h，得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。其中，加入糖醇可生成 NADPH，且使反应循环进行，降低了加入量以减少了生产成本。发明人基于现代生物 信息学思想，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段从白色念珠菌Candida a从ica/^克隆山梨糖还原酶的基因，在大肠杆菌中表达后发现其在水相中能够高效的催化COBE为⑶-CHBE，e. e值为100%。同时，通过在水/有机相中反应、 分批添加底物COBE等方式，解除了底物和产物对细胞和酶的抑制作用，显著的提高了转化效果。通过对山梨糖还原酶的基因进行重组表达，获得了具有新型催化功能的酶蛋白，开发了该条基因的新功能——催化非天然底物COBE为高立体选择性的(S)-CHBE。有益效果本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的山梨糖还原酶应用于 COBE不对称还原制备(S)-CHBE中，取得很好的效果，其酶活高达5. 6U/mg。氨基酸序列如 SEQ ID NO 2所示的山梨糖还原酶对底物COBE的得率高(大于90%)、产物CHBE的光学活性高(e.战为100%)，且产量高，大大降低了生产成本。
图1为山梨糖还原酶基因的构建图。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1
步骤一、山梨糖还原酶基因的获取
白色念珠菌 Candida albicansi^^ Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre)，培养基YPD (g ·厂1)酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖 20g，补蒸馏水至1L。将白色念珠菌Candida a从icaas接种于5mLYPD液体培养基中30°C培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒(北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试剂盒) 提取基因组。构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下
上游引物(SOUl-sense 含 NdeI)为5，- GGAATTCCATATGATGAGTGAAGAAATCATTTCA -3， 下游引物(SOUl-anti 含 EcoRI)为5，- CCGGAATTCTTATGGACATGTATAACCCCCAT -3， 所有引物均由美吉生物公司合成。基因的PCR条件
94 °C变性7 min，按如下参数循环30次94 °C变性1 min，60 °C退火50 s，72 ！延伸 1. 5 min。最后 72 °C延伸 10 min。步骤二、基因的表达用Nde I及EcoRI分别酶切pE T_22b (pET_22b购于Novagen (默克中国))及所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-22b与目的基因用T4连接酶进行连接过夜，将IOuL的连接产物pET-22b-S0Ul加入IOOuL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42°C热激 90sec。冰上放置2min。加入预热的0. 45mL培养基。220rpm 37°C Ih0将200uL菌液加入分别含有ΙΟΟμ g/mL的氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C过夜培养12— 16h。构建图谱见图1。步骤三、酶活的测定
挑取重组菌万.co/iRosseta (pET_22b_S0Ul)及出发大肠杆菌Rosseta (DE3)至含抗生素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。然后按2 %接种量分别接种到新鲜培养液中， 37 °C培养至OD600约为0. 6时，加入IPTG至终浓度0. 8 mmol · Γ1，25°C，220rpm，诱导表达 10 h后，离心(4°C，5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸钾缓冲(ρΗ7. 0)重悬，超声破碎细胞(功率300W,超声5s，间歇5s，共5min)，离心(4°C，12000rpm, 15min)，测定上清中的酶活。酶反应体系包括IOOmM 磷酸钾缓冲液(pH6. 0)，5mM NADPH，2OmM C0BE,30°C, 340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化1 μ mol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。结果显示，出发大肠杆菌Rosseta (DE3)的比酶活为0. 12U/mg，而重组菌E. coli Rosseta (pET22b_S0Ul)的比酶活为 5. 6U/mg。
步骤四、重组大肠杆菌万.co/i Rosseta (pET22b_S0Ul)的发酵挑取重组菌五co/iRosseta (pET_22b_ S0U1)至含抗生素的LB培养液，37°C振荡培养过夜。然后按2 %接种量分别接种到新鲜培养液中，37 °C培养至OD6tltl约为0.6时，加入 IPTG 至终浓度 0.8 mmol .L-1JSOJZOrpm,诱导表达 10 h 后，8000 rpm,4 °C 离心 10 min,
弃上清，沉淀备用。步骤五、取上述沉淀用磷酸钾缓冲(100 mmol -L-l, pH 6. 5)洗涤两次，称取0. 5g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于总体系25 mL的反应液中(pH 6.5磷酸钾缓冲与醋酸丁酯体积比为 1:1)。加入山梨醇 1300mmol/L，C0BE 200g/L，30°C，180rpm，16h。产物(S)-CHBE 的产量为180g/L，产物的得率为90%，光学纯度e.⑷为100%。产物的检测方法
对于水相反应反应结束后，8000 rpm离心10 min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。对于水/有机两相反应反应结束后8000 rpm离心10 min分离有机层和水层。 小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。PEG-20M毛细管柱，内标物为萘。程序为检测器FID，温度210°C，汽化室温度 210°C，柱温 150°C，柱头压 0. 03MPa，氢气 0. 05MPa，空气 0. IMPa,尾吹 0. 08MPa。用 HPLC 对⑶-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱Chiralcel 0B, 4. 6X250mm; Daicel Chemical Industries,日本)，检测条件流动相为正己烷正己烷(9 1)，波长 214nm，流量为0. 8mL/min,，R型禾口 S型CHBE的出峰时间分别为10. 5min禾口 11. 6min。
实施例2
如实施例1步骤一至步骤四，制备得沉淀备用，取上述沉淀用磷酸钾缓冲(100 mmol -L-1, pH 6. 5)洗涤两次，称取0. 5g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于总体系25 mL的反应液中(pH 6. 5磷酸钾缓冲与醋酸丁酯体积比为1:1)。加入甘露醇1300mmol/L，COBE 200g/L，30°C，180rpm，16h。产物(S)-CHBE 的产量为 185g/L，产物的得率为92. 5%，光学纯度e. 6%为100%。产物的检测方法同实施例1 实施例3
如实施例1步骤一至步骤四，制备得沉淀备用，取上述沉淀用磷酸钾缓冲(100 mmol -L-1, pH 6. 5)洗涤两次，称取0. 5g (湿重)的大肠杆菌菌泥，悬浮于总体系25 mL的反应液中(pH 6. 5磷酸钾缓冲与醋酸丁酯体积比为1:1)。加入木糖醇1300mmol/L，COBE 200g/L，30°C，180rpm，16h。产物(S)-CHBE的产量为130g/L，产物的得率为:65%，光学纯度 e. e% 为 100%。产物的检测方法同实施例1。
权利要求
1.一种山梨糖还原酶在生物法制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的山梨糖还原酶为催化剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于表达基因序列如SEQID NO :1所示的重组菌，与200mmol/L 2mol/L糖醇、1. 5 300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯，在pH6. 0 7. 5、2(T30°C、 18(T280rpm条件下反应16 20h，得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述糖醇为山梨醇。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述糖醇为甘露醇。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述糖醇为木糖醇。
全文摘要
本发明公开了一种山梨糖还原酶在生物法制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。即以氨基酸序列如SEQIDNO2所示的山梨糖还原酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以NADPH为辅因子，不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。本发明首次将氨基酸序列如SEQIDNO2所示的山梨糖还原酶应用于4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高达5.6U/mg，其对底物的得率高达90%、产物的对映体过量值为100％，且产量高，大大降低了生产成本。
文档编号C12R1/19GK102286556SQ201110225388
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者严明, 安明东, 李艳, 欧阳平凯, 蔡萍, 许晟, 许琳, 郝宁 申请人:南京工业大学