一种基于生物砖串联双酶制备l-叔亮氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于心叔亮氨酸制备技术领域，具体设及一种基于生物砖串联双酶制备 k叔亮氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] k叔亮氨酸作为一种非天然手性氨基酸，因其疏水性叔下基具有较大的空间位 阻，在有机合成中比较容易控制分子构象，已经被广泛应用于化工、食品医药行业，特别是 k叔亮氨酸作为一种手性药物中间体，用于合成生物抑制剂，抗病毒、抗癌等。因此k叔亮 氨酸具有较高的商业应用价值，例如施贵宝公司利用k叔亮氨酸作为药物中间体合成的 抗艾滋病毒药物阿扎他韦（Atazanavir) 2009年销售额为14亿美元。
[0003]k叔亮氨酸可通过化学合成法和生物合成法获得，但是化学合成法步骤多，对设 备要求严格，收率低，并且易污染环境，工艺复杂，而生物转化法具有反应条件溫和，对设备 要求低，收率高，工艺简单，手性选择性高，环境污染小等优点，生物转化法已经被广泛应用 于制备k叔亮氨酸的产业中。生物催化法制备k叔亮氨酸的方法可分为两个类：一是、 利用酶拆分化叔亮氨酸（如利用消旋酶，水解酶）和直接生物催化合成（如用亮氨酸脱氨 酶）。但是前者理想产物k叔亮氨酸的理论得率低于50 %，后者虽然理论得率高但是需要 利用额外添加大量昂贵的辅酶NADH。Krix等利用甲酸脱氨酶禪联亮氨酸脱氨酶，实现了 昂贵辅酶的再生，然而运种方法辅酶投入量高达2mM，经济性较差。CN102978251.A公开 的技术方案中中所用酶的投入量占底物的4%，且酶的用量太大，利用效率不高，不够经济。 WeimingLiu等利用双质粒表达甲酸脱氨酶和亮氨酸脱氨酶，实现了辅酶的再生，然而运种 方法需使用双倍的抗生素，不利于保护环境节约生产成本，且经济性较差。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于生物砖化iobrick)串联双 酶制备k叔亮氨酸的方法。
[0005] 本发明的具体技术方案如下：
[0006] -种基于生物砖串联双酶制备k叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)构建能够串联表达亮氨酸脱氨酶和甲酸脱氨酶的串联生物砖元件，其中亮氨 酸脱氨酶的基因序列如SEQIDOl所示，甲酸脱氨酶的基因序列如SEQID02所示；
[0008] (2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氨酶和甲 酸脱氨酶的E.COli工程菌；
[0009] (3)将上述E.COli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导 表达，获得发酵液，冷冻离屯、获得细胞，用P册.5~8. 5的缓冲液重悬、洗涂、配制成终浓度 为0. 05~lOOg/L的细胞液；
[0010] (4)将上述细胞液、=甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物 置于抑=6. 0~13的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物 k叔亮氨酸，=甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和辅助底物在上述缓冲体系中的终浓度分别为 0. 015 ~0. 300mol/l、0. 5 ~1. 5mol/l、0. 005 ~0. 2mmol/L和 0. 5 ~1. 5mol/l，上述辅酶 为NAD+或NADH，上述反应的溫度为20~45°C，反应的时间为20~12化，震荡速率为150~ 300巧m。
[0011] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1)为：
[0012] 1)构建能够单独表达所述亮氨酸脱氨酶的第一生物砖元件；
[0013] 2)构建能够单独表达所述甲酸脱氨酶的第二生物砖元件；
[0014] 3)用上述第一生物砖元件和第二生物砖元件构建能够串联表达亮氨酸脱氨酶和 甲酸脱氨酶的串联生物砖元件。
[0015] 进一步优选的，所述步骤1)为：
[0016]a、W含亮氨酸脱氨酶基因的质粒pucis-leu化为模板，用引物LeuDH-Fl和 LeuDH-Rl进行PCR扩增，得到亮氨酸脱氨酶基因序列，其中LeuDH-Fl和LeuDH-Rl分别如 沈QID3和沈QID4所示；
[0017]b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述亮氨酸脱氨酶基因序列及终止子B0015,用 T4DNA连接酶连接后形成质粒psBlC3-leu化-termintor转化大肠杆菌E.coliD册a扩大 培养，然后提取质粒psBlC3-leu化-termintor;
[0018] C、用甜al和PstI双酶切psBlC3-leu化-termintor，用SpeI和PstI双酶切 psBlC3-LacI-rbs_B0034,用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+LeuDH转化大肠杆菌 E.coliD册a扩大培养，然后提取质粒B0034+LeuDH，即得所述第一生物砖元件。
[0019] 进一步优选的，所述步骤2)为：
[0020] a、W含亮氨酸脱氨酶基因的质粒pUC18-f化为模板，用引物抑H-Fl和抑H-Rl进 行PCR扩增，得到甲酸脱氨酶基因序列，其中抑H-Fl和抑H-Rl分别如SEQID5和SEQID 6所示；
[0021]b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述甲酸脱氨酶基因序列及终止子B0015,用 T4DNA连接酶连接后形成质粒psBICS-JMh-termintor转化大肠杆菌E.coliD册a进行扩 大培养，然后提取质粒psBlC3-;Mh-te;rmintor;
[0022] C、用甜al和PstI双酶切psBlC3-f化-termintor，用SpeI和PstI双酶切 psBlC3-LacI-rbs_B0034,用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+FDH转化大肠杆菌E.COli D册a扩大培养，然后提取质粒B0034+抑H，，即得所述第二生物砖元件。
[0023] 进一步优选的，所述步骤如为：用甜al和PstI双酶切所述第一生物砖 元件，用SpeI和PstI双酶切所述第二生物砖元件，用T4DNA连接酶连接后形成质 粒B0034+LeuDH-B0034+抑H转化大肠杆菌E.COliD册a扩大培养，然后提取质粒 B0034+LeuDH-B0034+抑H，即得所述串联生物砖元件。
[0024] 在本发明的一个优选实施方案中，所述含氯霉素的液体扩大培养基的配方为：膜 蛋白腺6.0~15.Og/L，酵母浸膏1. 0~10.Og/L，化Cl5. 0~15.Og/L，抑7. 0~8.0,去 离子水为溶剂，接种前添加氯霉素至终浓度为50~150ug/mL;进一步优选的，所述步骤（3) 的培养条件如下：37°C，150~22化pm培养2~化后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10~ 30mg/ml，继续在25~30°C，150~250巧m下培养4~化。
[00巧]在本发明的一个优选实施方案中，所述氨基供体为氨水、甲酸锭、NH4CI和NH4NO3 中的至少一种。
[0026] 在本发明的一个优选实施方案中，所述辅助底物为甘油、葡萄糖、木糖、异丙醇和 半乳糖中的至少一种。
[0027] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3)中的缓冲液为PBS。
[0028] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（4)中的缓冲体系为Tris-盐酸、 NH4(n-氨水、乙酸钢缓冲体系、憐酸钟缓冲体系或碳酸钢缓冲体系。
[0029] 本发明的有益效果是：
[0030] 1、本发明的方法利用生物工程菌构建串联在生物砖原件上的亮氨酸脱氨酶和甲 酸脱氨酶来生产k叔亮氨酸，产品转化率高，手性选择性较好，反应条件溫和，操作简单， 昂贵的辅酶可再生，单细胞表达双酶节约成本，在生物催化制备手性叔亮氨酸领域具有较 好的工业应用前景，适合工业化生产。
[0031] 2、本发明在确保k叔亮氨酸的高产量的同时减少了抗生素，培养基和辅酶的用 量，效率高且成本低廉。
【附图说明】
[0032]图1为本发明实施例1构建的串联生物砖元件的结构示意图；
[0033] 图2为本发明实施例1制备的产物k叔亮氨酸的HPLC-UV手性色谱分析图。
[0034] 图3为本发明实施例1制备的k叔亮氨酸和D-叔亮氨酸的HPLC-UV手性色谱分 析图。
【具体实施方式】
[0035]W下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0036] 实施例1
[0037] -种基于生物砖串联双酶制备k叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：
[0038] (1)构建能够串联表达亮氨酸脱氨酶和甲酸脱氨酶的串联生物砖元件（如图1所 示），其中亮氨酸脱氨酶的基因序列如SEQIDOl所示，甲酸脱氨酶的基因序列如SEQID 02所示，具体包括：
[0039]1)构建能够单独表达所述亮氨酸脱氨酶的第一生物砖元件，具体为：
[0040]a、W含亮氨酸脱氨酶基因