的质粒pucis-leu化为模板，用引物LeuDH-Fl和 LeuDH-Rl进行PCR扩增，得到亮氨酸脱氨酶基因序列，其中LeuDH-Fl和LeuDH-Rl分别如 沈QID3和沈QID4所示；
[0041]b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述亮氨酸脱氨酶基因序列及终止子B0015,用 T4DNA连接酶连接后形成质粒psBlC3-leu化-termintor转化大肠杆菌E.coliD册a扩大 培养，然后提取质粒psBlC3-leu化-termintor;
[0042]C、用甜al和PstI双酶切psBlC3-leu化-termintor，用SpeI和PstI双酶切 psBlC3-LacI-rbs_B0034,用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+LeuDH转化大肠杆菌 E.COliD册a扩大培养，然后提取质粒B0034+LeuDH，即得所述第一生物砖元件；
[0043] 2)构建能够单独表达所述甲酸脱氨酶的第二生物砖元件，具体为：
[0044]a、W含亮氨酸脱氨酶基因的质粒pUC18-f化为模板，用引物抑H-Fl和抑H-Rl进 行PCR扩增，得到甲酸脱氨酶基因序列，其中抑H-Fl和抑H-Rl分别如SEQID5和SEQID 6所示；
[0045]b、用EcoRI和SpeI分别双酶切上述甲酸脱氨酶基因序列及终止子BOO15，用 T4DNA连接酶连接后形成质粒psBICS-Wh-termintor转化大肠杆菌E. coli D册a进行扩 大培养，然后提取质粒psBlC3-;Mh-te;rmintor ;
[0046]C、用甜al和PstI双酶切psBICS-JMh-termintor，用SpeI和PstI双酶切 psBlC3-LacI-rbs_B0034,用T4DNA连接酶连接后形成质粒B0034+FDH转化大肠杆菌E.COli D册a扩大培养，然后提取质粒B0034+FDH，，即得所述第二生物砖元件；
[0047] 3)用上述第一生物砖元件和第二生物砖元件构建能够串联表达亮氨酸脱 氨酶和甲酸脱氨酶的串联生物砖元件，具体为：用甜al和PstI双酶切所述第一生 物砖元件，用SpeI和PstI双酶切所述第二生物砖元件，用T4DNA连接酶连接后形成 质粒B0034+LeuDH-B0034+抑H转化大肠杆菌E.COliD册a扩大培养，然后提取质粒 B0034+LeuDH-B0034+抑H，即得所述串联生物砖元件；
[0048] (2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氨酶和甲 酸脱氨酶的E.COli工程菌；
[0049] (3)将上述E.COli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导 表达，获得发酵液，冷冻离屯、（4°C，800化pm，IOmin)获得细胞，用抑6. 5~8. 5的PBS缓冲液 重悬，充分洗涂后离屯、，重复操作2次，配制成终浓度为lOOg/L的细胞液，所述含氯霉素的 液体扩大培养基的配方为：膜蛋白腺6. 0~15. 0邑/1，酵母浸膏1. 0~10. 0g/L^C15. 0~ 15.Og/L，抑7. 0~8. 0,去离子水为溶剂，接种前添加氯霉素至终浓度为50~150ug/mL;该 步骤的培养条件如下：37°C，150~22化pm培养2~化后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为 10~30mg/ml，继续在25~30°C，150~250巧m下培养4~化；
[0050] (4)将上述细胞液、=甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物 置于抑=7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔 亮氨酸，具体反应体系为：〇.〇15mol/LS甲基丙酬酸，0.5mol/LNH4CI-NH3缓冲体系， 0. 005血ImM的NADH，上述反应的体积为15血，反应的溫度为37°C，反应的时间为2她，震荡 速率为18化pm。
[0051] (5)分离与检测：步骤（4)反应后的物料离屯、去除沉淀，上清液加入等体积的甲 醇，混合震荡均匀，离屯、弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物k叔 亮氨酸的收率为99. 61 %，e.e.值大于99.0%。产物心叔亮氨酸用高效液相色谱检测，色 谱柱为化irex3126,检测波长254nm，结果如图2和图3所示。其检测条件为：流动性为含 有2mM的CuS〇4的95/5的水/异丙醇溶液；柱溫为35°C;流速为Iml/min。
[00閲实施例2
[00閲步骤（1)至步骤（3)同实施例1，步骤（4)如下：
[0054] 将上述细胞液、S甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于抑 =7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔亮氨酸， 具体反应体系为：〇. 030mol/LS甲基丙酬酸，Imol/LNH4CI-NH3缓冲体系，0. 005血ImM的 NADH，上述反应的体积为15mU反应的溫度为37°C，反应的时间为化，震荡速率为18化pm。 步骤反应后的物料离屯、去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离屯、弃掉沉 淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物k叔亮氨酸的收率为90. 82%，e.e.值大于 99. 0%。
[00财实施例3
[005引步骤（1)至步骤（3)同实施例1，步骤（4)如下：
[0057] 将上述细胞液、=甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于 抑=7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔亮氨 酸，具体反应体系为：5%的氨水，0. 060mol/LS甲基丙酬酸，Imol/LNHaCI-MIs缓冲体系， 0. 005血ImM的NADH，上述反应的体积为15血，反应的溫度为37°C，反应的时间为12h，震荡 速率为18化pm。步骤反应后的物料离屯、去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均 匀，离屯、弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物k叔亮氨酸的收率为 85. 39%，e.e.值大于 99. 0%。
[00则实施例4
[005引步骤（1)至步骤（3)同实施例1，步骤（4)如下：
[0060] 将上述细胞液、=甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于 抑=7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔亮氨 酸，具体反应体系为：5%的氨水，0.lOOmol/LS甲基丙酬酸，Imol/LNH4CI-NH3缓冲体系， 0. 005血ImM的NADH，上述反应的体积为15mL，反应的溫度为37°C，反应的时间为2也震荡 速率为18化pm。步骤反应后的物料离屯、去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均 匀，离屯、弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物k叔亮氨酸的收率为 82. 32%，e.e.值大于 99. 0%。
[00川实施例5
[006引步骤（1)至步骤（3)同实施例1，步骤（4)如下：
[0063] 将上述细胞液、=甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于 抑=7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔亮氨 酸，具体反应体系为：10%的氨水，0. 150mol/LS甲基丙酬酸，Imol/LNH4CI-NH3缓冲体系， 0. 005血ImM的NADH，上述反应的体积为15血，反应的溫度为37°C，反应的时间为32h，震荡 速率为18化pm。步骤反应后的物料离屯、去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均 匀，离屯、弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物k叔亮氨酸的收率为 72. 30%，e.e.值大于 99. 0%。
[0064] 实施例6
[006引步骤（1)至步骤（3)同实施例1，步骤（4)如下：
[0066] 将上述细胞液、S甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于抑 =7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔亮氨酸， 具体反应体系为：10%的氨水，0. 200mol/LS甲基丙酬酸，1. 5mol/LNH4CI-NH3缓冲体系， 0. 005血ImM的NADH，上述反应的体积为15mL，反应的溫度为37°C，反应的时间为4她，震 荡速率为18化pm。步骤反应后的物料离屯、去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均 匀，离屯、弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物k叔亮氨酸的收率为 65. 92%，e.e.值大于 99. 0%。
[0067] 实施例7
[006引步骤（I)至步骤（3)同实施例I，步骤（4)如下：
[0069] 将上述细胞液、S甲基丙酬酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于抑 =7.0的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物k叔亮氨酸， 具体反应体系为：10%的氨水，0. 300mol/LS甲基丙酬酸，1. 5mol/LNH4C