一种高纯度琼胶酶的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高纯度琼胶酶的制备工艺。
【背景技术】
[0002]琼胶是一种从江篱、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成，琼胶糖是由1，3连接的β -D-半乳吡喃糖和1，4连接的3，6-内醚-a -L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖。硫琼胶结构较复杂，含有D-半乳糖、3，6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸[I]。琼胶酶能降解琼胶多糖，这些降解产物在很多方面有重要应用，而且，琼胶酶在分子生物学等方面也多有应用，因此，对于琼胶酶的研究具有重要的意义。
[0003]用途也较为广泛，可作为天然防腐剂、高甜度甜味剂的充填剂及分散剂、功能性食品基料、抗氧化剂、在药物方面的应用，利用琼胶酶开发琼脂低聚糖产品，可极大地拓宽琼脂在食用和医药工业中的应用。为了能充分发挥琼胶酶及其酶解产物在国民经济中的作用，进一步提升我国人民的健康水平，今后的工作重点应是加强琼胶酶的基础性研究，拓宽琼胶酶的来源，大力开发琼胶酶酶解产物中具有活性功能的物质，力求形成一个新的产业，一个新的经济增长点。
[0004]迄今为止，有少数几种琼胶酶的基因得到了克隆和测序，目前研究证实，即使有些β -琼胶酶的功能相似，但它们的氨基酸序列、分子量、底物特异性、反应特性等方面存在着很大的差异。由于缺乏琼胶酶，琼脂酶和琼脂低聚糖制备工艺技术在国内尚为空白。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供了高纯度琼胶酶的制备工艺，使得琼胶酶的制备工艺制得高高纯度琼胶酶，纯化效率得到提高，便于工业化的大规模生产与推广。
[0006]为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现:
一种高纯度琼胶酶的制备工艺，制备工艺步骤如下:
O菌种筛选:从琼脂原料中筛选琼胶酶的微生物，经分离，得到纯种微生物，再进行相对高产的菌株分离，将菌株做分子鉴定，并保存备用；
2)发酵:将步骤I)的菌株作为初始菌落，按菌落起始工作体积的5%接种，再做二次菌株培养，并根据相关参数进行控制，根据菌体的生长情况和酶的产量，确定发酵工艺；
3)纯化工艺:在确定的发酵工艺基础上，首先进行盐析进行粗纯，而后通过层析柱进行精纯，获得满足临床诊断需求的精制酶。
[0007]优选地，所述的步骤2)中相关参数的控制为:①溶氧及转速:空气流速0.5-lvvm,最低搅拌转速为200-400 r/min,分批阶段控制溶解氧在40 %，补料阶段设定在20 %，发酵罐提高或降低转速自动控制；(DpH值:自动流加25%的氨水和50%磷酸，使pH值保持在7.0 ;③温度:28°C，自动控制。
[0008]优选地，所述的步骤3)纯化工艺的具体操作为:首先将发酵液通过硫酸铵沉淀粗纯，将酶液的体积浓缩10?20倍，以便于粗酶液的保存；在精纯过程中，将粗酶液分成若干份，控制每批精制酶的纯化规模。
[0009]优选地，将最终制成的精制酶进行外观、纯度以及效价的检测评估。
[0010]优选地，所述的步骤2)中发酵的方式为补料分批发酵。
[0011]本发明提供了一种高纯度琼胶酶的制备工艺，筛选分离获得琼胶酶的产生菌，经发酵优化、亲和层析介质纯化分离和稳定化技术，高效制备高纯度琼胶酶产品。工艺可放大至生产规模，有望实现琼胶酶的产业化，填补国内空白。利用制备的高纯度琼胶酶，采用可控酶解技术，制备琼脂低聚糖产品，拓宽琼脂在食品工业中的应用。琼脂低聚糖产品可填补国内空白。
【具体实施方式】
[0012]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0013]本实施例提供一种高纯度琼胶酶的制备工艺，制备工艺步骤如下:
O菌种筛选:从琼脂原料中筛选琼胶酶的微生物，经分离，得到纯种微生物，筛选以琼脂为唯一碳源，再进行相对高产的菌株分离，将菌株做分子鉴定，并保存备用；
2)发酵:将步骤I)的菌株作为初始菌落，按菌落起始工作体积的5%接种，再做二次菌株培养，并根据相关参数进行控制，根据菌体的生长情况和酶的产量，确定发酵工艺；在稳定、可控的大规模培养过程中实现高产目标。发酵的方式为补料分批发酵；
3)纯化工艺:在确定的发酵工艺基础上，首先进行盐析进行粗纯，而后通过层析柱进行精纯，获得满足临床诊断需求的精制酶。
[0014]步骤2)中相关参数的控制为:①溶氧及转速:空气流速0.5-lvvm,最低搅拌转速为200-400 r/min，分批阶段控制溶解氧在40%，补料阶段设定在20%，发酵罐提高或降低转速自动控制?’②PH值:自动流加25%的氨水和50%磷酸，使pH值保持在7.0 ;③温度:28 °C，自动控制。
[0015]酶最易在纯化阶段失活，因此纯化环节将是生产效率和生产成本控制的最为核心的步骤。步骤3)纯化工艺的具体操作为:首先将发酵液通过硫酸铵沉淀粗纯，将酶液的体积浓缩10?20倍，以便于粗酶液的保存；在精纯过程中，将粗酶液分成若干份，控制每批精制酶的纯化规模。根据已经完成的前期酶的精制工作，后继的纯化工艺研究主要包括:纯化体系的放大、纯化效率提高和纯化成本的降低。
[0016]将最终制成的精制酶进彳丁外观、纯度以及效价的检测评估。
[0017]步骤2)中发酵的方式为补料分批发酵。大大节约了在制备发酵过程中的成本，可进一步推广应用。
[0018]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种高纯度琼胶酶的制备工艺，其特征在于，制备工艺步骤如下: 1)菌种筛选:从琼脂原料中筛选琼胶酶的微生物，经分离，得到纯种微生物，再进行相对高产的菌株分离，将菌株做分子鉴定，并保存备用； 2)发酵:将步骤1)的菌株作为初始菌落，按菌落起始工作体积的5%接种，再做二次菌株培养，并根据相关参数进行控制，根据菌体的生长情况和酶的产量，确定发酵工艺； 3)纯化工艺:在确定的发酵工艺基础上，首先进行盐析进行粗纯，而后通过层析柱进行精纯，获得满足临床诊断需求的精制酶。2.如权利要求1所述的高纯度琼胶酶的制备工艺，其特征在于，所述的步骤2)中相关参数的控制为:①溶氧及转速:空气流速0.5-lvvm,最低搅拌转速为200-400 r/min,分批阶段控制溶解氧在40%，补料阶段设定在20%，发酵罐提高或降低转速自动控制值:自动流加25%的氨水和50%磷酸，使pH值保持在7.0 ;③温度:28°C，自动控制。3.如权利要求1所述的高纯度琼胶酶的制备工艺，其特征在于，所述的步骤3)纯化工艺的具体操作为:首先将发酵液通过硫酸铵沉淀粗纯，将酶液的体积浓缩10?20倍，以便于粗酶液的保存；在精纯过程中，将粗酶液分成若干份，控制每批精制酶的纯化规模。4.如权利要求1所述的高纯度琼胶酶的制备工艺，其特征在于，将最终制成的精制酶进行外观、纯度以及效价的检测评估。5.如权利要求1所述的高纯度琼胶酶的制备工艺，其特征在于，所述的步骤2)中发酵的方式为补料分批发酵。
【专利摘要】本发明提供一种高纯度琼胶酶的制备工艺，涉及生物技术领域。通过1）菌种筛选：从琼脂原料中筛选琼胶酶的微生物，经分离，得到纯种微生物，再进行相对高产的菌株分离，将菌株做分子鉴定，并保存备用；2）发酵：将步骤1）的菌株作为初始菌落，按菌落起始工作体积的5％接种，再做二次菌株培养，并根据相关参数进行控制，根据菌体的生长情况和酶的产量，确定发酵工艺；3）纯化工艺：首先进行盐析进行粗纯，而后通过层析柱进行精纯。整个制备工艺使得筛选分离获得琼胶酶的产生菌，经发酵优化、亲和层析介质纯化分离和稳定化技术，高效制备高纯度琼胶酶产品。可进一步推广应用。
【IPC分类】C12N9/24, C12N9/42
【公开号】CN105331597
【申请号】CN201510759047
【发明人】陈振祥
【申请人】福建省金燕海洋生物科技股份有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月10日