专利名称：一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵生产领域，尤其涉及一种以木薯淀粉工业的废弃物一木薯渣为原料，利用两种嗜热菌共培养产氢气及水解原料，再利用酵母快速发酵生产酒精的方法
背景技术：
化石能源的逐渐枯竭要求我们开发可替代的持续性清洁新能源，近年来氢气和燃料酒精的生产量也不断增加。利用各种生物质和工农业废料为原料被认为是降低新能源成本并代替传统能源的有效途径。然而，目前大部分能源酒精都是以玉米淀粉或糖类农作物为原料生产的，因此导致了粮食的紧张和价格的上升，而且原料成本非常高，阻碍了新能源产业的发展。国家政策规划要求不与人争粮，解决成本和政策上的巨大挑战最有希望的途径就是利用低品位生物质生产燃料酒精和氢气。原材料和酶的成本在燃料酒精和氢气生产中占有较大比重，在目前纤维素乙醇和氢气生产还无法产业化的背景下，以工业废料——木薯渣为原料进行直接发酵，降低原料成本并省去酶的费用对于生产能源酒精和氢气具有重要意义。本发明开发了一种以木薯■为原料，以嗜热厌氧菌 C7o5·tridium thermocellum 禾Π Thermoanaerobacterium aotearoense以及酒精酵母Saccharomyces cerevisiae为发酵菌种的同时产乙醇和氢气的集成生物系统，不需要进行原材料的预处理和酶的添加。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用木薯渣发酵生产能源酒精和氢气的方法，该方法以木薯渣为原料不仅省去了燃料酒精和氢气生产过程中的原材料及预处理以及酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业的环境污染问题。本发明通过如下技术方案实现。一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括以下步骤
(1)两种嗜热厌氧菌种子液的制备低温保存的两种嗜热厌氧菌C/^irii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium ao tearoense经西林瓶活化和血清瓶培养，分别制得在培养48小时黄色物质明显及0. 6^1. 1的两种种子液；两种种子液的培养基采用MTC培养基，分别以纤维素和木糖作为碳源；
(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加4(T120g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封，并重复抽真空和充氮气，最后在115 130°C下灭菌20 40分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的嗜热菌种子液以59Γ15%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，发酵温度为50 60 °C，摇床转速为100 300 rpm，发酵72 108小时后， 收集血清瓶上部的氢气；
(4)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将酵母种子液以59Γ15%的接种量接种至嗜热发酵后的醪液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为3(T37°C，发酵12 24小时后终止发酵。上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(4)所述酵母种子液由如下方法获得将低温保存的酒精酵母经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数大于1XIO8个/ mL的酵母种子液；其中种子培养基采用YPD培养基，组成为酵母粉10 g/L,蛋白胨10 g/ L，葡萄糖20 g/L，斜面时添加15 g/L琼脂，该培养基初始pH为4.CT7.0。上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(1)所述低温均为-20，-80 或者-196 0C0上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(1)所述MTC培养基配方包括A、B、C、D和E液，A液为菌体生长所需的碳源，CZo1S irii/iws thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense所需碳源分别为纤维素和木糖；B液包括柠檬酸三钾盐、一水柠檬酸、硫酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠；C液包括氯化铵、尿素和酵母抽提物； D液包括六水氯化镁、四水氯化亚铁和二水氯化钙、一水半胱氨酸盐酸；E液包括二盐酸吡哆胺、对氨基苯甲酸、D-生物素、维生素和维生素。上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(1)所述MTC培养基配方中， A、B、C、D、E 液 5 种成分按体积比 45 :2 :1 :1 :1 混合；A 液中 Clostridium thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense所需的碳源含量分别为3 g/L的纤维素和5 g/L的木糖；B液中含有柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液中含有氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物 50 g/L ;D液中含有六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ;E液中含有二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L 和维生素 B1 0.2 g/L。上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(2)所述的发酵培养基为稍作改变的MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按体积比45 :2 :1 :1 :1混合；A液为菌体生长所需的碳源，即40-120 g/L的木薯渣；B液中含有柠檬酸三钾盐50 g/ L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62. 5 g/L;C液中含有氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L ;D液中含有六水氯化镁50 g/ L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ;E液中含有二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L和维生素 B1 0. 2 g/L。上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(2)所述的重复抽真空和充氮气为抽真空和充ο. 0Γ0. 04MPa的氮气3次。上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤(4)所述的酒精酵母是 Saccharomyces Cerevisiae0本发明中的木薯渣是木薯淀粉工业中的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素， 具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接利用和水解，不需外加酶水解即可用于能源酒精和氢气的集成发酵，而且具有负成本的特点。因此，以木薯渣发酵同时生产能源酒精和氢气不仅省去了淀粉和纤维素发酵生产酒精过程中原材料、预处理及酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题，具有极大的示范和推广价值。
本发明所述的方法具有以下优点
1.发酵所用的原料是木薯淀粉工业中的废弃物——木薯渣，含有颗粒细小的淀粉、纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接利用和水解， 而且具有负成本的特点。2.木薯渣在不经过预处理和不外加酶的情况下即可被直接转化成氢气和可发酵性糖，进而转化为乙醇，可以有效降低生产成本。3.采用集成生物系统方法，在发酵过程中将能源酒精和氢气的生产结合起来，工艺非常简单，可以有效降低投资费用和生产成本。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式
作进一步说明。实施例1
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将-80°C保存的Clostridium thermocellum经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，培养18小时制得ODmi ^0. 6的种子液；其中培养基采用MTC 培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45:2:1 :1 :1 ( K/K )用无菌注射器混合。A液为3 g/L的纤维素。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ;D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ;E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/ L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. OlMPa的氮气3次，最后在115 °C下灭菌40分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum种子液以10% 的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55°C，摇床转速为 150rpm，发酵72小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到2. 71mmoL·(4)_801保存的酒精酵母5^4<^0耶《^ Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为4. 0 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至经嗜热发酵的培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为30°C，发酵12小时终止发酵，酒精含量达到 7. 12 g/L。 实施例2
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将_20°C保存的Thermoanaerobacterium aotearoense 经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，培养24小时制得OD·、8的种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45:2:1:1:1 ( K/Y )用无菌注射器混合。A液为5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/ L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ;C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ;D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/ L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ;E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D_生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 02MPa的氮气3次，最后在121°C下灭菌30分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Tkermoanaerobacterium aotearoense种子液以5%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为50°C，摇床转速为lOOrpm，发酵96小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到2. Olmmol。(4)-20°C保存的酒精酵母feccferoffij^M Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为7. 0 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以15%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为33°C，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到 7. 96 g/L ο 实施例3
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将-196 °C保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，分别制得在培养48小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及ODmi 1. 1的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45 2 1 1 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种C/osirii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense 的 A 液分另Ij为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/L、维生素B12 0. 1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 04MPa的氮气3次，最后在130°C下灭菌20分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1 1的比例，15%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为60°C，摇床转速为200rpm，发酵96小时后， 收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4. 55mmoL·(4) -196°C保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5. 0 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以5%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37°C，发酵20小时后终止发酵，酒精含量达到 8.93 g/L。 实施例4
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将_80°C保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，分别制得在培养36小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及ODmi 1. 0的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45 2 1 1 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种C/osirii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense 的 A 液分另Ij为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/L、维生素B12 0. 1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 04MPa的氮气的过程3次，最后在121°C下灭菌30分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1 2的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55°C，摇床转速为250rpm，发酵84小时后， 收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4. 35mmoL·(4)_801保存的酒精酵母5^4<^0耶《^ Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5. 5 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37°C，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到
8. 80 g/Lο
实施例5
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将_80°C保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，分别制得在培养24小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及ODmi 0. 8的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45 2 1 1 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种C/osirii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense 的 A 液分另Ij为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/L、维生素B12 0. 1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 04MPa的氮气3次，最后在121°C下灭菌30分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium ao tearoense种子液以1:4的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55°C，摇床转速为150rpm，发酵72小时后， 收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4. 47mmoL·(4)_801保存的酒精酵母5^4<^0耶《^ Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5. 5 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至嗜热发酵液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为37°C，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到9. 14 g/L。 实施例6
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将_80°C保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium ao tearoense经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，分别制得在培养24小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及ODmi 0. 8的 Thermoanaerobac terium ao tearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45 2 1 1 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种C/osirii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium ao tearoense 的 A 液分另Ij 为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/L、维生素B12 0. 1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加60 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 04MPa的氮气3次，最后在121°C下灭菌30分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobac terium ao tearoense种子液以1:9的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55°C，摇床转速为150rpm，发酵84小时后， 收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4. 53mmoL·(4)_801保存的酒精酵母5^4<^0耶《^ Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5. 5 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37°C，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到 10.26 g/L。 实施例7
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将_80°C保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，分别制得在培养24小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及ODmi 1. 0的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45 2 1 1 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种C/osirii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense 的 A 液分另Ij为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/L、维生素B12 0. 1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加80 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 04MPa的氮气3次，最后在115°C下灭菌40分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以4:1的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55°C，摇床转速为150rpm，发酵84小时后， 收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4. 61mmoL·(4)_801保存的酒精酵母5^4<^0耶《^ Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5. 0 ；
(5)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以8%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37°C，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到 10.93 g/L ο 实施例8
利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下
(1)嗜热厌氧菌种子液的制备将_80°C保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经IOmL西林瓶活化和IOOmL血清瓶放大，分别制得在培养36小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及ODmi 1. 0的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45 2 1 1 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种C/osirii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense 的 A 液分另Ij为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L的木糖。B液柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62. 5 g/L ；C液氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/L、维生素B12 0. 1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加120 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0. 04MPa的氮气3次，最后在115°C下灭菌30分钟；
(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以9:1的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55°C，摇床转速为300rpm，发酵108小时后， 收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4. 72mmol。(4)-80°C保存的酒精酵母feccferofflj^M Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到IO8个/mL的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/ L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5. 5 ；
乙醇发酵嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以5%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37°C，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到 10.64 g/L。
权利要求
1.一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括以下步骤(1)两种嗜热厌氧菌种子液的制备低温保存的两种嗜热厌氧菌C/^irii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense经西林瓶活化和血清瓶培养，分别制得在培养48小时黄色物质明显及0. 6^1. 1的两种种子液；两种种子液的培养基采用MTC培养基，分别以纤维素和木糖作为碳源；(2)发酵培养基的制备及灭菌发酵培养基中添加4(T120g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封，并重复抽真空和充氮气，最后在115 130°C下灭菌20 40分钟；(3)嗜热发酵及氢气的收集将制备好的嗜热菌种子液以59Γ15%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，发酵温度为50 60 °C，摇床转速为100 300 rpm，发酵72 108小时后， 收集血清瓶上部的氢气；(4)乙醇发酵嗜热发酵结束后，将酵母种子液以59Γ15%的接种量接种至嗜热发酵后的醪液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为3(T37°C，发酵1214小时后终止发酵。
2.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤(4)所述酵母种子液由如下方法获得将低温保存的酒精酵母经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数大于1 X IO8个/mL的酵母种子液；其中种子培养基采用YPD培养基。
3.根据权利要求2所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于所述YPD培养基配方为酵母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L ；斜面时添加15 g/L 琼脂；该培养基初始PH为4. (Γ7. 0。
4.根据权利要求1或2所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于所述低温均为-20，-80或者-196 V。
5.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤(1)所述MTC培养基配方包括A、B、C、D和E液，A液为菌体生长所需的碳源，C/oWrii/i thermocellum 禾口 Thermoanaerobacterium aotearoense 所需碳源分另Ij为纤维素禾口木糖；B 液包括柠檬酸三钾盐、一水柠檬酸、硫酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠；C液包括氯化铵、尿素和酵母抽提物；D液包括六水氯化镁、四水氯化亚铁和二水氯化钙、一水半胱氨酸盐酸； E液包括二盐酸吡哆胺、对氨基苯甲酸、D-生物素、维生素和维生素。
6.根据权利要求5所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤(1)所述MTC培养基配方中，A、B、C、D、E液5种成分按体积比45 :2 :1 :1 :1混合；A液中 Clostridium thermocellum禾口Thermoanaerobacterium aotearoense 所需的碳源含量分另lj 为3 g/L的纤维素和5 g/L的木糖；B液中含有柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62. 5 g/L ;C液中含有氯化铵75 g/L、 尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L ;D液中含有六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、 二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ;E液中含有二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L和维生素B1 0.2 g/L。
7.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤(2)所述的发酵培养基为稍作改变的MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按体积比45 :2 :1 :1 :1混合；A液为菌体生长所需的碳源，即40-120 g/L的木薯渣；B 液中含有柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31. 25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62. 5 g/L;C液中含有氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L ； D液中含有六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ；E液中含有二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0. 2 g/L、D-生物素0. 1 g/ L、维生素B12 0.1 g/L和维生素B1 0.2 g/L。
8.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤(2)所述的重复抽真空和充氮气为抽真空和充0. 0Γ0. 04MPa的氮气3次。
9.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤(4)所述的酒精酵母是SaccAarofflJ^e1S cerevisiae.
全文摘要
本发明公开了一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括两种嗜热厌氧菌和酵母种子液制备，发酵培养基制备及灭菌，嗜热发酵及氢气的收集和乙醇发酵等过程。集成发酵过程中，嗜热发酵72-108小时后，接种酵母继续发酵12-24小时，使发酵醪液酒精含量达到7.12g/L以上，发酵效率达到75%以上，终止发酵。本发明中的木薯渣是木薯淀粉工业中的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接水解和利用，不需外加酶水解即可用于乙醇和氢气的集成发酵，而且具有负成本的特点，可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题。
文档编号C12R1/01GK102286600SQ201110225800
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者朱明军, 李平 申请人:华南理工大学