专利名称：一种基因、重组质粒及在提高植物果实硬度和延长果实货架期方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种基因、重组质粒及在提高植物果实硬度和延长果实货架期方面的应用。
背景技术：
果实发育成熟过程中发生一系列生理生化变化，不仅包括生长，还包括风味、芳香物质、质地、颜色和硬度的变化。其中软化是果实发育成熟和采后最明显的质地变化，而且几乎是所有果实的一个特征。这种变化一方面使果实的适口性和风味发生变化，达到最理想的食用状态，但另一方面果实软化后更容易受到物理伤害和病原侵染，使贮藏寿命缩短。目前多数焦点集中在对果实成熟衰老相关酶类如ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸) 合成酶(ACS)、ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶(ACO)及与细胞壁降解相关的酶如多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基酯酶(PE)、β-半乳糖苷酶等的研究。例如，通过导入反义PG 基因，使正常型番茄里的PG基因失活，PG的产生受阻，从而使番茄的货架期延长(寇晓红等，2003，多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因对加工番茄果实成熟的影响，中国食品学报)； 将番茄的乙烯合成酶(EFE)反义基因导入到番茄基因组中，获得的转基因植株中乙烯的合成受到显著抑制，这种番茄的果实在成熟时的变红程度减轻，并且在室温下贮藏时更能抵抗成熟过度和皱缩(李广存等，1999，番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建，山东农业科学)；在番茄中表达ACS反义mRNA，使得乙烯的生物合成大大降低，果实不能正常成熟，不出现呼吸高峰，在空气中放置90 120天也不变红变软，只有加了外源乙烯或丙烯才能诱导呼吸高峰的出现和果实的成熟(刘传银等，1998，番茄ACC合成酶cDNA 克隆及其对果实成熟的反义抑制，生物工程学报)。然而，以上提高果实耐储性和货架期的成功并不能解决果实的采后运输和贮藏问题。目前主栽加工番茄、草莓等品种都不同程度存在果实硬度差的缺陷，加之种植规模大， 采后运输和加工前处理技术粗放，使果实在采后运输过程中出现挤压裂果，加工前大量烂果，严重影响加工品质及生产效益，因此提高果实硬度是生产中亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一个新的基因、真核重组质粒及其制备方法，所述基因在植物中过量表达可提高植物果实的硬度，延长植物果实的货架期。本发明的技术方案如下本发明所述基因，命名为S1C0BRA，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所述， 所表达的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所述。该基因的克隆根据DFCI数据库(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/)中 EST 序列(TC174193)，利用引物设计软件I^rimer Premier 5. 0设计PCR特异引物，从番茄成熟叶片中提取总RNA，利用反转录 PCR(RT-PCR)技术从番茄中分离到一个1804bp的cDNA序列，分析得到一个1335bp的开放阅读框(如序列表中SEQ ID NO 1所示)。本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO 1所述基因和改造后的真核表达载体构成，所述改造后的真核表达载体是用序列表中SEQ ID NO :3所述核苷酸序列替换原始真核表达载体(现有真核表达载体)中的35S启动子而形成的真核表达载体，序列表中SEQID NO 1所述基因两端在改造后的真核表达载体中的连接位点分别为)(baI、SacI。本发明所述真核重组质粒的制备方法，其步骤如下(1) IH 据 GeneBank 中的序列 X95261 禾口 Sol genomics network 中的序列 SL2. 40sc03685设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个果实特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:3所述；(2)将步骤(1)得到的果实特异性启动子替换原始真核表达载体(现有真核表达载体)中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；(3)将序列表中SEQ ID NO 1所述基因连接到改造后的真核表达载体上，该基因两端的连接位点分别为^(bal、SacI，即获真核重组质粒。本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述原始真核表达载体(现有真核表达载体)为 pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7、YFP-pBA、pBI121 中的一种。将本发明所述真核重组质粒转化番茄，获得转基因植株。实验表明本发明所述基因在番茄果实中过量表达，可引起外果皮表皮细胞下的厚角组织层数增加及表皮细胞的细胞壁增厚；同时成熟果实的果皮细胞壁纤维素含量明显增加，且显著降低了水溶性果胶含量。与野生型番茄果实相比，转基因番茄果实的表皮硬度、表皮厚度均明显提高。果实耐压力实验表明，在果实红熟期，转基因番茄果实的硬度约为对照番茄果实的两倍；在同样的室温储存条件下，转基因番茄果实的失重率明显降低，储存期可比对照番茄果实延长20天左右。因而，本发明所述真核重组质粒可在提高植物果实硬度和延长植物果实的货架期方面应用。本发明具有以下有益效果1、本发明为提高植物果实硬度或可压缩性(Compresihility)，延长植物果实货架期提供了一种新的基因和真核重组质粒，有利于植物品质的改良。2、由于植物果实硬度增加，在采后运输和储存过程中将会大大减少挤压裂果、加工前烂果的发生，具有明显的经济效益。3、本发明所用的基因为植物本身自有的基因，所以转基因植物的安全性能高。4、本发明所述基因的克隆和植物转基因均为常规方法，所需材料易于获取。
图1是一种本发明所述真核重组质粒(pBIVT-SlCOBRA)的示意图，用于在番茄中表达。图2是番茄果皮的显微分析照片，其中，照片A是野生型番茄(WT)绿熟期果皮石蜡切片(safranin ο染色)的照片，照片B是本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄 (OE)绿熟期果皮石蜡切片(safranin ο染色)的照片，照片C是野生型番茄(WT)未熟期 (25DPA)果皮石蜡切片(safranin ο染色)的照片，照片D是本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄(OE)未熟期果皮石蜡切片(safranin ο染色)的照片。
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图3是用质构仪(TA. XT Plus)对未熟期、绿熟期、红熟期番茄果皮穿刺距离的分析图(P/2N探头)，图中，WT代表野生型番茄果实，0E-5代表本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实，CS-2代表本发明所述S1C0BRA基因的共抑制株系番茄果实。图4是用质构仪(TA. XT Plus)对未熟期、绿熟期、红熟期番茄果实表皮强度的分析图(P/2N探头)，图中，WT代表野生型番茄果实，0E-5代表本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实，CS-2代表本发明所述S1C0BRA基因的共抑制株系番茄果实。图5是用质构仪(TA.XT Plus)对绿熟期、红熟期番茄果实抗压强度的分析图 (P/100探头)，图中，WT代表野生型番茄果实，0E-5代表本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实，CS-2代表本发明所述S1C0BRA基因的共抑制株系番茄果实。图6是用拉力机对番茄果皮最大折断力的分析图，图中，WT代表野生型番茄果皮， 0E-5代表本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果皮，CS-U CS_2、CS-3代表三种本发明所述S1C0BRA基因的共抑制株系番茄果皮。图7是用拉力机对番茄果皮弹性强度的分析图，图中，WT代表野生型番茄果皮， 0E-5代表本发明所述S1C0BRA基因过量表达的番茄果皮，CS-U CS_2、CS-3代表三种本发明所述S1C0BRA基因的共抑制株系番茄果皮。图8是番茄果实的耐储性照片，其中，A照片左边为本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实在室温条件下储存40天后正面的照片，A照片右边为野生型番茄果实在室温条件下储存40天后的照片；照片B是本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实在室温下储存40天后其背面的照片；照片C是本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实在室温下储存40天后其剖面的照片。图9是红熟期番茄果实在储存过程中的鲜重损失率图，图中，WT-1、WT-2、WT-3为三种野生型番茄果实，0E-4、0E-5、0E-6为三种本发明所述S1C0BRA基因过量表达株系番茄果实。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 :S1C0BRA基因的克隆1、试剂限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、I^rimeStar热启动高保真DNA聚合酶、pMDIS-T克隆载体等购自大连宝生物工程公司；Trizol试剂购自北京天为时代科技有限公司；反转录试剂盒购自日本Tc^oBo公司；质粒提取及DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品，可直接从市场多家公司(企业)购买。2、大肠杆菌菌株和植物材料大肠杆菌克隆菌株为E. coli JM109，购自Clontech公司。番茄野生型种子为AC+， 可通过市场购买。
3、培养基和溶液LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7. 0，高压灭菌。SOB 培养基胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 0. 58g/L，KCl 0. 19g/L， IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 调 pH 至 7. 0，高压灭菌。SOC 培养基S0B+20mM 葡萄糖。TB buffer (临用前配置)IMKCl 4mL, 0. 45M MnCl22. 4mL, 0. 50M CaCl2O. 6mL, 0. 50M K-MES 0. 5mL, ddH20 12. 5mL(总体积 20mL)。IOOXMg2+ 溶液:20. 33g MgCl2. 6H20 和 24. 65g MgSO4. 7H20 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。20%葡萄糖溶液20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,过滤除菌。IM KCl 溶液7. 45g KCl 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。0. 45M MnCl2 溶液8. 9g MnCl2. 4H20 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。0. 50M CaCl2 溶液7. 35g CaCl2. 2H20 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。0. 50M K-MES 溶液9. 76g MES 定容于 IOOmL H2O,用 KOH 调 pH 至 6. 3，过滤除菌， 分装成0. 5mL每管，-20°C储存。DMSO 分装 200 μ 1 新鲜 DMSO，_20°C 储存。4、实验方法4. 1质粒微量提取1)将带有克隆载体PMD18-T质粒的E. coli JM109接种于装有5ml LB培养液(含氨苄青霉素)的试管中，37°C搖床培养12 Whr，以扩增质粒。2)取1. 5 5ml的菌液，于室温下10，OOOxg离心lmin。倒净培养基，往沉淀中加 Λ 250 μ 1的溶液I (solution I) /RNaseA (购自OMEGA公司)混和(合)液，漩涡振荡使细
胞完全重新悬浮。3)往重悬混合液中加入250 μ 1溶液II (solution II，购自OMEGA公司)，翻转试管4 6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。4)往上述裂解液中加入350ul溶液III (solution III，购自OMEGA公司)，并上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10，OOOxg离心lOmin。5)取一干净的质粒微量分离柱置于2ml收集试管上(已备)，将上清转至质粒微量分离柱内，确保转至柱内的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10，OOOxg离心lmin，使裂解液完全流过分离柱。6)弃去离心甩出液，加入500 μ 1的HB缓冲液(购自OMEGA公司)到质粒微量分离柱上，室温下10，OOOxg离心Imin洗涤分离柱，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所
需的高质量DNA。7)弃去收集液，加入700 μ 1用无水乙醇稀释的清洗缓冲液洗涤质粒微量分离柱， 室温10，OOOxg离心lmin，弃去洗涤液。8)可选做步骤重复步骤7，用700 μ 1清洗缓冲液再洗涤质粒微量分离柱一次。9)室温下10，OOOxg离心空分离柱^iiin以甩干质粒微量分离柱基质。10)把质粒微量分离柱置于一干净的1. 5ml离心管上，直接加入30 50 μ 1灭菌去离子水或TE缓冲液液到质粒微量分离柱基质上(所加的量取决于预期终产物浓度)， 10，OOOxg离心Imin以洗脱出DNA04. 2DNA回收方案1)处理琼脂糖凝胶-EB电泳混和物以分别分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。2)当带纹间的间距达到能够与其他杂带区分的时候，在紫外灯上把所需的DNA片段切下来。这样就能保证把含DNA的凝胶尽可能多的取出来3)通过把凝胶薄片装在1. 5ml小离心管中称其重量的方法，近似地确定其体积。 例如其密度为lg/ml，于是凝胶的体积便可通过如下方法得到凝胶薄片的重量为0. 2g则其体积为0. 2mL·加入体积为凝胶薄片体积3 4倍的NJ缓冲液形成混合物，将所述混合物置于55 65°C水浴中温浴lOmin，。4)把750 μ 1的DNA-琼脂糖溶液加到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，并把回收纯化柱装在一个干净的2ml收集管内，室温下于10，OOOxg离心lmin，弃去液体。5)选做步骤用300 μ 1 NJ缓冲液来洗涤回收纯化柱，并在10，OOOx g下离心 lmin。6)用750 μ 1无水乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤回收纯化柱。室温下10，OOOxg 离心lmin。7)弃去流出液，重复步骤6) —次。8)弃去液体，把回收柱10，OOOxg离心Imin以甩干残余的液体。9)把回收纯化柱装在一个干净的1. 5ml离心管上，加入30 50 μ 1 10, OOOxg离心(具体取决于预期的终产物浓度)的灭菌去离子水(或者ΡΗ8. O的TE缓冲液)到柱基质上，10，OOOxg离心Imin以洗脱DNA04. 3番茄叶片RNA提取1)液氮研磨番茄幼嫩的叶片，按50_100mg组织/ml Trizol (购自北京天为时代科技有限公司)加入Trizol，震荡，室温放置5min。2) 12，OOOrpm 离心 5min。3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，震荡15s，室温放置!3min。4) 4 °C 12，00(^离心15111土11。5)取上清，加入0. 5ml异丙醇混勻，室温放置IOmin。6) 40C 12，OOOg 离心 lOmin，弃上清，RNA 沉于管底。7)按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。8) 4"C 8，OOOg 离心 5min，尽量弃上清。9)室温干燥5-lOmin (RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。10)用 50ul DEPC-H2O 溶解 RNA 样品，55_60°C，5-lOmin。4. 4RT-PCR1)引物合成上海invitrogen生物技术有限公司合成S1C0BRA-F 1 :5’ -TGAACAGACATTGCCTACAGAGA-3’S1C0BRA-R1 :5’ -CAAGGTGTTTATCCGGTTTCT-3’在冰上对一个200 μ 1 EP管中加入以下组分
5 xRT Buffer4 μ
dNTP Mixture( 10 mM)2 μ
RNase Inhibitor( 10 U/μΙ)1 μ
01igo(dT)20(10pmol/^)1 μ
Total RNAX μ
RNase-Free H2O(Il-X) μ
ReverTra Ace1 μ 按以下程序进行反转录42°C反应20min ；95°C酶变性5min ；4°C保存5min。 2) PCR
PCR反应体系
5><PrimeStar Buffer10 μ
dNTP Mixture(各2.5 mM )4 μ
RT产物1 μ
S1C0BRA-F11 μ
S1C0BRA-R11 μ
ddH2032.5 μ
PrimeStar0.5 μ 按以下程序进行扩增94°C预变性:3min ；94°C变性10s，58°C复性30s，72°C延伸
2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72 °C 5终延伸min。通过上述操作，获得了用于构建pBI-SlCOBRA番茄表达重组质粒的S1C0BRA基因。4. 5高保真PCR产物加尾以及和克隆载体pMD18_T连接在第二轮高保真PCR产物中加1 μ ITaq DNA聚合酶，72°C反应15min即可。若PCR
产物不纯，则必须先回收纯化目标片段，再加入适量的PCR Buffer、dNIPs和Taq DNA聚合
酶进行加尾。加尾后的PCR产物与克隆载体pMDIS-T按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下
IOxligase Buffer1 μ
pMD18-T (50μ§/μ1)1 μ
加尾的PCR产物( 150昭尔1) 1 μ Ligase (350 U/μΙ)1 μ
ddH206 μ 16°C连接 12 小时。4. 6大肠杆菌转化
8
1)感受态细胞的制备a)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37°C过夜培养；b)转接0. 5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18 °C震荡18 24h至 OD600 ^ 0. 55 ；c)将培养液转入50mL离心管中，冰浴IOmin, 4°C 4000rpm离心IOmin ；d)去上清，加16mL冰上预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混勻)，冰浴10min，4°C 4000rpm离心IOmin ；e)去上清，加4mL冰上预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280 μ 1的DMSO并混勻，冰浴 IOmin ；f)分装于冰上预冷的1. 5mL EP管中，液氮冻存。2)转化a)从液氮中取出一管感受态细胞冰浴解冻；b)将10 μ 1连接产物与感受态细胞混勻，冰浴30min ；c)42°C热冲击 90s，立即冰浴 l_2min ；d)加 0. 8mL 的 S0C,混勻，37°C温和摇床 Ih0e)室温13，OOOrpm离心lmin，倒掉一部分上清液，留约200 μ 1的上清液，用枪头将上清液与细胞混勻，涂布含有氨苄青霉素(50yg/ml)的LB平板，37°C培养12小时。4.7细胞快速裂解法鉴定重组质粒1)挑取单个转化子接种于500 μ 1含相应抗生素的LB培养液中，37°C振荡培养至 A600 为 06 0.8。2)取20(^1菌液至0.51111离心管中，13，000印111离心11^11，去上清，留约2(^1上清。3)力口 20 μ 1 2 X 快速裂解液
，剧烈振荡。4) 13000rpm 离心 15min。5)取5μ 1上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。4.8菌落PCR鉴定重组质粒经过快速裂解法鉴定的重组质粒再做菌落PCR以确定插入片段是否为目标片段，
反应体系如下
IOxPCR Buffer Mg2+(1.5 mM)
2 μ 1 .2 μ .6 μ 1 μ
dNTP Mixture (各2.5 mM)
菌液
S1COBRA-F1 S1COBRA-R1 ddH20
12.4 μ 1 μ
0.4 μ 0.4 μ
Taq DNA聚合酶
反应条件94°C预变性5min ；94°C变性40s，58°C复性30s，72°C延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72 °C终延伸5min。对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，测序结果为序列表中SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。实施例2 :S1C0BRA基因在番茄中表达的真核重组质粒的构建1、材料1.1试剂与材料1)菌株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a，购自天为时代公司。2)质粒pMD18-T 载体衍生自 pUC18，2. 692Kb，Ampr，为克隆 PCR 产物(ΤΑ Cloning)的专用载体，插入位点为EcoRV的酶切位点，购自TaKaRa。质粒pSKint (以下简写pSK) :Amp抗性，具有两处多克隆位点。植物表达真核载体pBI121 含有选择标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因及 β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因，购自天为时代公司。2、方法2. 1提取番茄幼果的总DNA(1)取IOOmg新鲜番茄幼果，在添加液氮状况下研成细粉，分装于1. 5mL离心管中， 每管加入500yL 65°C预热的2XCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(IOOmmol/ LTris-Hcl pH 8. 0,20mmol/L 乙二胺四乙酸 pH8. 0，1. 4mol/LNaCl，40mmol/L 2-巯基乙醇， 2% CTAB)混勻。(2) 65°C水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿。(3)5000g离心lOmin，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA。(4) 12000g离心lOmin，弃上清留沉淀，用70%乙醇至少洗两遍，吹干沉淀。(5)将沉淀溶于 200yL TE 中，加入 RNase A (10mg/mL)，37°C 保温 30min，加入等体积的酚/氯仿，混勻。(6) 12000g离心lOmin，取上清，加入1/10体积3mol/L NaAc和2. 5倍体积的无水乙醇，室温放置IOmin。(7) 1200(^离心1011^11，弃上清，用70%乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于201^ ddH20中。2. 2真核表达载体的改造IH 据 GeneBank 中的序列 X95261 禾口 Sol genomics network 中的序列 SL2. 40sc03685设计PCR特异引物，以本实施例2. 1提取的番茄幼果总DNA为模板进行PCR 扩增。果实特异性启动子的PCR特异引物如下TFM7-F TCTAAGCTTAATTAACTTGATTTTGAGTCCATG (HindIII)TFM7-R GACTCTAGAGGGCAATGAACAAAGTTCCAA (XbaI)按以下程序进行扩增94°C预变性5min ；94°C变性40s，58°C复性30s，72°C延伸 2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72 °C终延伸5min。高保真PCR产物经电泳回收后，然后进行普通Tag酶加尾。再把加尾的片段与PMD18-T克隆载体连接，然后转化大肠杆菌(JM109)，挑单克隆，提阳性克隆质粒后，送测序公司测序，得到SEQ ID NO :3所述核苷酸序列，命名为果实特异性启动子TFM7。用限制酶HindIII ^P XbaI酶切果实特异性启动子TFM7，用相同限制酶酶切 PBI121真核表达载体，然后将酶切后的TFM7和pBI121载体进行连接(连接位点=HindIII 和^CbaI)，从而得到改造后的真核表达载体——PBIVT02. 3S1C0BRA基因在番茄中表达的真核重组质粒的构建构建在番茄中表达的真核重组质粒(pBIVT-SlCOBRA)的引物如下S1C0BRA-F2 :5， -cgaTCTAGA TGAACAGACATTGCCTACAGAGA-3， (XbaI)S1C0BRA-R2 :5， -cgaGAGCTC CAAGGTGTTTATCCGGTTTCT3-3， (SacI)按以下程序进行扩增94°C预变性5min ；94°C变性40s，58°C复性30s，72°C延伸 2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72 °C终延伸5min。高保真PCR产物经电泳回收后，然后进行普通Tag酶加尾。再把加尾的片段与 PMD18-T克隆载体连接，然后转化大肠杆菌(JM109)，挑单克隆，提阳性克隆质粒后，送测序公司测序，得到SEQ ID NO :1所述序列，命名为S1C0BRA基因。用限制酶)(bal和Mel酶切S1C0BRA基因，同时用相同限制酶酶切本实施例中2. 2 所述PBIVT载体，然后将酶切后的S1C0BRA基因与酶切后的pBIVT载体连接(连接位点 XbaI和&icl)，获得含S1C0BRA基因的真核重组质粒，命名为pBIVT-SlCOBRA，其结构见图 1。实施例3 :S1C0BRA基因在番茄中的表达1、材料1.1试剂与材料1)菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 购自天为时代公司。2)植物激素吲哚乙酸(IndoleaceticAcid, IAA)；激动素(Kinetin，Kt) ；6_ 苄氨基嘌呤 (6-Benzylaminopurine, 6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone, ACE) ；2，4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4~D)。3)抗生素羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin)4)植物DNA提取缓冲液IOOmmol/L Tris .Cl(pH8. 0)，50mmol/L EDTA(pH8. 0)，500mmol/L NaCl,10mmol/L α-巯基乙醇，10%或20% SDS。5)培养基与溶液酵母提取物lg/L，胰蛋白胨 5g/L，蔗糖 5g/L，MgSO4. 7H20 0. 5g/L。用 NaOH 调 pH 至7.0，高压灭菌。番茄转化过程中所用培养基如下(表1)表1番茄组织培养所用培养基
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权利要求
1.一种基因，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:1所述。
2.一种真核重组质粒，其特征在于由权利要求1所述基因和改造后的真核表达载体构成，所述改造后的真核表达载体是用序列表中SEQ ID NO :3所述核苷酸序列替换原始真核表达载体中的35S启动子而形成的真核表达载体，权利要求1所述基因两端在改造后的真核表达载体中的连接位点分别为^(bal、SacI。
3.根据权利要求2所述的真核重组质粒，其特征在于所述原始真核表达载体为pHB、 pM0N1772、pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI121 中的一种。
4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下(1)根据GeneBank 中的序列 X95261 禾口 Sol genomics network 中的序列 SL2. 40sc03685设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个启动子，所述启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:3所述；(2)将步骤(1)得到的启动子替换原始真核表达载体中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；(3)将权利要求1所述基因连接到改造后的真核表达载体上，该基因两端的连接位点分别为)(bal、SacI，即获真核重组质粒。
5.根据权利要求4所述的真核重组质粒的制备方法，其特征在于所述原始真核表达载体为 pHB、pM0N1772、pBE12、pBC7，YFP-pBA、pBI 121 中的一种。
6.权利要求2所述的真核重组质粒在提高植物果实硬度中的应用。
7.权利要求2所述的真核重组质粒在延长植物果实货架期方面的应用。
全文摘要
一种基因，它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO1所述。一种真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO1所述基因和改造后的真核表达载体构成。一种真核重组质粒的制备方法，步骤为(1)根据GeneBank中的序列X95261和Sol genomics network中的序列SL2.40sc03685设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO3所述的启动子；(2)将步骤(1)得到的启动子替换原始真核表达载体中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；(3)将序列表中SEQ ID NO1所述基因连接到改造后的真核表达载体上，即获真核重组质粒。所述真核重组质粒可在提高果实硬度和延长果实货架期中应用。
文档编号C12N15/79GK102296077SQ20111024158
公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者刘永胜, 唐晓凤, 曹颖 申请人:四川大学