专利名称：对dna目标序列进行信号放大和检测的方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测技术领域。具体来说，涉及一种基于单脱碱基荧光探针与内切酶IV的放大体系，利用该放大体系实现高选择性、高灵敏度的低丰度基因突变检测。
背景技术：
基因突变与人类的癌症密切相关，一些重要的突变可以作为癌症诊断、治疗和预后评价的生物标志物，所以基因突变的检测有着重大的临床意义。但是，由于肿瘤处在不同时期、远端转移以及肿瘤细胞与正常细胞融合等因素的影响，基因突变通常表现为低丰度。 因而要求检测方法既具有高灵敏度(检测到很低的绝对量)，又要具有高选择性(在众多野生型链中选出突变链)。最常用的检测基因突变的方法是测序，包括Sanger sequencing和 Pyrosequencing，测序方法能够提供具体的序列组成，但是该方法的选择性不够，检测限只能达到5% -20%，而且，样品的前处理过程非常繁琐复杂。基于PCR的序列特异性荧光探针法(实时荧光PCR)克服了检测限低的问题，兼具高灵敏度和高选择性，但是PCR过程中实时检测对探针的设计有很多限制性要求，包括探针3’末端不能与引物配对，探针与引物的距离受一定限制等等。近年来，发展了一些基于序列特异性探针的信号放大方法。主要包括限制性内切酶放大体系和外切酶III信号放大体系。这两种方法都具有很高的灵敏度，能够检测到 Ifmol的匹配DNA序列。但是它们也有一些缺陷限制性内切酶放大体系由于使用的是限制性内切酶，因而对待测目标链有一定的序列要求，从而大大限制了该方法在实际中的应用范围。而外切酶III放大体系中的外切酶III无法在较高温度(50°C以上)工作，体系的检测温度低于错配与匹配双链的熔解温度，从而使探针的区分能力大大丧失。因此，迫切需要开发出能选择性放大突变信号的放大体系，用于高选择性、高灵敏度的低丰度突变检测。
发明内容
本发明目的是建立一种可选择性放大突变信号的放大体系，实现高选择性、高灵敏度的低丰度基因突变检测。本发明的技术方案是，利用单脱碱基探针的区分作用，结合内切酶IV的切割，达到信号放大的目的，从而检测DNA目标序列，尤其是含有特异性位点(如突变位点)的目标序列。在本发明的一方面，提供了一种对DNA目标序列进行信号放大和检测的方法，包括如下步骤1)制备单脱碱基的双标记荧光探针，该探针为单链DNA，一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，除脱碱基位点外，其序列与DNA目标序列完全匹配，脱碱基位点距离探针5’末端和3’末端5个核苷酸残基以上；2)将所述探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV，在47-60°C的检测温度下进行实时荧光测定，在检测温度下，探针与目标序列特异性结合，所形成的双链空位被内切酶 IV识别并切割，切割后的探针碎片从目标序列上解离下来，发出荧光，而释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，实现目标序列的信号放大和检测，所检测到的荧光强度越高表明待测体系中目标序列的含量越高，其中，所述检测温度低于探针与目标序列形成的双链的熔解温度，但高于探针与待测体系中其他序列形成的双链的熔解温度。本发明的探针是单脱碱基DNA探针，可以通过化学合成法直接制备得到单一位点脱碱基(嘌呤或嘧啶)的DNA单链，也可以通过其他途径获得，例如先制备含有单一尿嘧啶(U)脱氧核苷酸位点的双标记荧光探针，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(toacil DNA-glycosylase, UDG)处理，切除尿嘧啶碱基，剩下脱氧核糖残基，得到单脱碱基探针 (AP-probe)。上述方法所检测的DNA目标序列通常是指具有特异性位点(如突变位点)的DNA 序列，下面以基因突变的检测为例说明本发明的原理。在基因突变的检测中，除脱碱基位点外，单脱碱基探针序列与突变体完全匹配，因此，与野生链有一个或多个碱基(针对单突变或多突变位点)是错配的。由于错配的影响， 探针与突变链形成的匹配双链(perfect-match duplex, PM)的熔解温度(记作Tpm)比探针与野生链形成的错配双链(mismatch duplex,MM)的熔解温度(记作Tmm)高。于是，当把检测温度(记作T)升至两熔解温度之间时，即Tmm < T < TPM，探针与野生链形成的双链无法稳定存在而解链，探针却可以在该温度下特异性地结合突变链。考虑到区分能力和非特异性结合，探针的长度一般设置为20-30核苷酸残基，相应的检测温度一般会在50-60°C。内切酶IV是一种脱嘌呤/嘧啶(AP)核酸内切酶，水解DNA上的完整AP位点，切割 5’端与AP位点相连的第一个磷酸二酯键，产生3’羟基和5’脱氧核糖磷酸末端。内切酶IV 的推荐工作温度为37°C，所以必须要探究酶在较高温度(50-60°C)下是否具有活性。通过测试本发明的信号放大体系在47-60°C之间能否实现信号放大，证实内切酶IV在47-56°C 之间具有很高的活性，60°C时具有一定的活性。因此，本发明的放大体系在47-60°C之间都能正常工作。在合适的温度下，单脱碱基探针选择性地与突变链杂交，形成双链空位。内切酶IV 具有切割双链空位的性质，并且其切割速率远大于切割单链空位的速率。因此，探针与突变链形成的双链空位被内切酶IV识别并切割。切割后的探针碎片，由于长度较短，无法在检测温度下与目标链结合，于是从目标链上解离下来。解离前，完整探针两端的荧光基团和猝灭基团由于荧光共振能量转移(FRET)而处于猝灭状态，解离后，两基团远离，荧光基团不再被猝灭，从而发出荧光信号。同时，解离释放出的目标链可以继续与另一个单脱碱基探针结合，重复上述过程，实现信号的放大。可用于本发明的荧光基团及其猝灭基团应当满足荧光基团的发射光谱与猝灭基团的吸收光谱有效重叠，从而发生高效率的FRET。常见的包括FAM与TAMRA ；FAM与BHQl ； TET与BHQ2等等。在本发明的另一方面，提供了一种对DNA目标序列进行信号放大和检测的试剂盒，在一定检测温度下，利用内切酶IV对特异性结合于DNA目标序列上的单脱碱基的双标记荧光探针进行切割，使探针碎片从目标序列上解离下来，产生荧光信号，同时，解离后的目标序列可以与另一个单脱碱基探针结合，重复上述过程，实现信号的放大，从而实现目标序列的信号放大和检测；该试剂盒包括单脱碱基的双标记荧光探针和内切酶IV，其中所述探针为DNA单链，一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，除脱碱基位点外，其序列与DNA 目标序列完全匹配，脱碱基位点距离探针5’末端和3’末端5个核苷酸残基以上。进一步的，所述探针长度一般设置为20-30核苷酸残基。所述探针上的荧光基团和猝灭基团选自常用的FRET基团对，如荧光基团FAM和猝灭基团BHQl，荧光基团FAM和猝灭基团TAMRA，荧光基团TET和猝灭基团BHQ2。相比于现有技术，本发明在检测低丰度基因突变上具有一些显著的优点(1).普适性，由于内切酶IV的识别位点仅仅是双链空位，且空位的位置可以根据所要测定的目标序列灵活的设计空位被切割后形成的两个碎片短链的熔解温度比完整单脱碱基探针的熔解温度低10°c以上就可以达到较好的放大效果。一般而言，空位位置与探针5’末端和3’末端相距5个碱基以上可以满足要求。所以，该信号放大和检测方法可以适用于任何目标序列。(2).高选择性，内切酶IV耐热性使反应体系能够在相对高温下工作，从而有效利用了错配熔解温度差异的性质，同时，一个目标链与多个探针结合，实际上是进行了多次选择，选择性也得到了放大，从而实现了超高选择性的检测，选择性比其他信号放大方法高出
一个数量级。(3).低检测限，由于在检测过程中，一个目标链与多个探针循环发生结合-切割-解离的过程，发出多个探针的荧光信号，实现了目标链信号的放大，所以用本发明方法检测低丰度突变，能够检测到低至的突变体，比其他PCR后检测方法的检测限都要低。(4).联用性，本发明方法可以方便的与PCR联用，包括选择性PCR如AS-PCR， C0LD-PCR，实现更灵敏的检测。与其他方法相比，联用只需要加入相关的酶和探针，操作简单易行。
图1是应用本发明对DNA目标链进行信号放大和检测的原理示意图。图2是实施例1对低浓度DNA目标序列进行检测的荧光值变化曲线。图3是应用本发明对低丰度突变进行信号放大和检测的原理示意图。图4是实施例2对低丰度突变进行检测的荧光值变化曲线。
具体实施例方式下面结合附图，通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1<低浓度匹配DNA序列检测>在该实施例中，目标物为完全匹配的DNA单链，实验中设置一系列DNA单链的浓度梯度，希望能检测到尽可能少的目标链。检测原理参见图1，具体步骤如下1.使用UDG酶处理含有尿嘧啶脱氧核苷酸残基的双标记荧光探针，得到单脱碱基探针；2.将得到的单脱碱基探针与不同浓度的目标DNA序列混合，然后加入内切酶IV， 迅速测定混合溶液内切酶IV荧光值随时间的变化。在该实施例中，设计的探针序列如下5，-FAM-TCGTCTCCACUGAAACATACTCCATAA-TAMRA-3，(SEQ ID No. 1)目标序列碱基组成如下5’-GTTTTAAATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 2)不同浓度目标序列的50 μ L反应体系中探针量5pmol ；目标序列量5pmol， Ipmol，0· lpmol，IOfmol，Ifmol ；各反应体系中加入IU的内切酶IV。空白对照体系探针5pmol，目标序列量0。热程序53°C 900s,每k测定一次荧光值。荧光测定仪器为实时荧光PCR仪rotor-gene 6000，检测时检测器的灵敏度(gain level)为7. 33。检测结果荧光值变化曲线如图2所示，在反应前100s，荧光值随着时间逐渐增大，7min后，目标序列量多于Ipmol的反应体系中，荧光值达到平台。实施例2<低丰度突变检测>在该实施例中，待测体系为野生链、突变链的混合体系，两种链的总量为5pmol，但设置一系列不同的突变比例，希望能检测到尽可能低的突变比例。检测原理参见图3，具体实施步骤如下1.制备单脱碱基探针，方法同实施例1中步骤1 ；2.分别测定单脱碱基探针与野生链、突变链形成的双链的熔解温度，确定合适的检测温度；3.将单脱碱基探针与含有不同比例突变链的混合目标体系混合，加入内切酶IV， 迅速升温至步骤2中确定的检测温度，测定荧光值随时间的变化。在该实施例中，设计的探针序列如下5，-FAM-TCTCCACf/GA A ACATACTCCA-BHQ1-3，(SEQ ID No. 3)突变链序列组成如下5' -GTTTTAAATTATGGAGTATGT T TCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3 ‘ (SEQ ID No. 4)野生链序列组成如下5' -GTTTTAAATTATGGAGTATGT G TCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3 ‘ (SEQ ID No. 5)(黑体下划线标记的是突变碱基的位置)不同比例突变体的50 μ L反应体系探针量5pmol ；突变比例100%，10%，5%， 2. 5%，1%，混合链总量均为5pmol ；各反应体系中加入IU的内切酶IV。空白对照组探针量5pmol ；突变比例0%。热程序52. 50C 600s,每k测定一次荧光值。荧光测定仪器为实时荧光PCR仪rotor-gene 6000，检测时检测器的灵敏度(gain level)为6. 77。检测结果荧光值变化曲线如图4所示，荧光值随着时间逐渐增大，突变体含量 100 %的体系中，荧光值迅速达到平台。
权利要求
1.一种对DNA目标序列进行信号放大和检测的方法，包括如下步骤1)制备单脱碱基的双标记荧光探针，该探针为单链DNA，一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，除脱碱基位点外，其序列与DNA目标序列完全匹配，脱碱基位点距离探针5’末端和3’末端5个核苷酸残基以上；2)将所述探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV，在47-60°C的检测温度下进行实时荧光测定，在检测温度下，探针与目标序列特异性结合，所形成的双链空位被内切酶IV 识别并切割，切割后的探针碎片从目标序列上解离下来，发出荧光，而释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，实现目标序列的信号放大和检测，所检测到的荧光强度越高表明待测体系中目标序列的含量越高，其中，所述检测温度低于探针与目标序列形成的双链的熔解温度，但高于探针与待测体系中其他序列形成的双链的熔解温度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)通过化学合成法制备所述单脱碱基的双标记荧光探针。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)先制备含有单一尿嘧啶脱氧核苷酸位点的双标记荧光探针，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶对其进行处理，切除尿嘧啶碱基，得到单脱碱基的双标记荧光探针。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA目标序列是指含有突变位点的DNA 序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针长度为20-30核苷酸残基。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光基团和猝灭基团是下列基团对之一 =FAM 和 TAMRA，FAM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
7.—种对DNA目标序列进行信号放大和检测的试剂盒，在一定检测温度下，利用内切酶IV对特异性结合于DNA目标序列上的单脱碱基的双标记荧光探针进行切割，使探针碎片从目标序列上解离下来，产生荧光信号，同时，解离释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，从而实现目标序列的信号放大和检测；该试剂盒包括单脱碱基的双标记荧光探针和内切酶IV，其中所述探针为DNA单链，一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，除脱碱基位点外，其序列与DNA目标序列完全匹配，脱碱基位点距离探针5’末端和 3’末端5个核苷酸残基以上。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针长度为20-30核苷酸残基。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团和猝灭基团是下列基团对之一 FAM 和 TAMRA，FAM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA目标序列是指含有突变位点的 DNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种对DNA目标序列进行信号放大和检测的方法，制备单脱碱基的双标记荧光探针，该探针一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，除脱碱基位点外，其序列与DNA目标序列完全匹配；在一定检测温度下，该探针与目标序列特异性结合形成双链空位，利用内切酶IV识别并切割该双链空位，切割后的探针碎片从目标序列上解离下来，产生荧光信号，而解离释放出的目标序列可以继续与另一个探针结合，重复上述过程，从而实现目标序列的信号放大和检测。本发明方法可实现高选择性、高灵敏度的低丰度基因突变检测。
文档编号C12Q1/68GK102296116SQ20111025911
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者宋晨, 张晨, 肖先金, 苏昕, 赵美萍 申请人:北京大学