专利名称：Fxyd6胞内区蛋白的表达和纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及FXYD6胞内区蛋白的表达与纯化。
背景技术：
FXYD6基因定位于11号染色体长臂(llq23. 3)，FXYD6蛋白是FXYD家族新成员，全称为包含FXYD结构域的转运调节因子6 (FXYD domain-containing ion transportregulator 6)。它属于单跨膜蛋白，其结构包含有细胞外固定的FXYD序列的单跨膜片段，为离子通道或离子通道调节器。FXYD6蛋白作为膜蛋白的功能区分布信号肽位于第l-18aa，胞外区位于19_38aa，跨膜区位于39_56aa，57_95aa是胞内区。FXYD6对于大鼠生后和成熟大脑的神经元的兴奋性有很大的作用，然而在FXYD6与精神分裂症的易感性的相关性方面的研究，美国、日本和中国的研究者得出的结论不一致。近期的研究显示FXYD6蛋白通过调节Na+-K+-ATPase的活性，有助于产生和维持内淋巴的内耳蜗势能和保证离子成分稳定，有助于内耳听神经的平衡功能。有关FXYD6与肿瘤关系的研究鲜见报道，但FXYD家族突变或缺失很可能引起严重病理变化。国内周宁新教授领导的课题小组在对FXYD6与肿瘤的关系方面做了深入的研究，首先从不同分化胆管癌组织中分离得到的差异表达的L2cDNA片段，反向Northern杂交证实它在正常胆管组织低表达，在胆管癌组织中高表达，且在不同分化胆管癌组织中表达差异显著，在低分化胆管癌中高表达，而高分化胆管癌中相对低表达。FXYD6 unigene拼接序列中包含L2cDNA，与定位于llq23. 3的FXYD基因家族中的新基因FXYD6高度同源(同源性98. 90%),并从组织cDNA文库(肝、脑)获得FXYD6基因全长序列。随后又在基因和蛋白水平上对FXYD6在胆管癌组织表达进行了研究，发现人FXYD6基因在RNA水平上，在正常胆管、胆管癌中均存在表达，基因的表达量在正常胆管与胆管癌之间存在明显差异，与胆管癌分化程度呈负相关。体外实验证实，人FXYD6反义核酸可明显抑制人胆管癌细胞细胞(QBC939)的体外增殖能力。出现上述研究结果的可能原因为FXYD6基因定位于11号染色体长臂(llq23. 3)，而11号染色体长臂是包括胆管癌、胰腺癌、肝癌在内的多种肿瘤细胞最常见的异常区。因此表达并纯化FXYD6蛋白，进而制备FXYD6蛋白的单克隆抗体，可以为研究该分子在大脑组织中的具体功能和一些肿瘤发生及进展过程中的分子作用机制提供重要的工具。检测该分子在不同组织中的分布情况，定量检测FXYD6蛋白也有助于我们对一些肿瘤的早期诊断及鉴别诊断。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种经过纯化的FXYD6胞内区蛋白，为研究该分子在大脑组织中的具体功能和一些肿瘤发生及进展过程中的分子作用机制提供工具。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种FXYD6胞内区蛋白的表达和纯化的方法，其步骤如下a.采用核苷酸序列如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物对，利用PCR技术扩增FXYD6胞内区基因；b.将扩增出的FXYD6胞内区基因插入到已用BamH I和Xho I双酶切后的表达载体PGEX-6P-1中，构建重组载体pGEX-6P-l-FXYD6胞内区；C.将重组载体PGEX-6P-1-FXYD6胞内区转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达FXYD6胞内区蛋白；d.表达的FXYD6胞内区蛋白采用蛋白质免疫印记(Western Blot)进行鉴定，之后通过亲和层析柱进行纯化，经过纯化的蛋白再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
鉴定纯度。如上所述的方法，其中，所述宿主细胞优选为原核细胞。如上所述的方法，其中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌。·一对用于FXYD6胞内区蛋白的表达和纯化的引物，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。一种可在宿主细胞中表达FXYD6胞内区蛋白的重组载体，其是采用核苷酸序列如SEQ ID No :2和SEQ ID No :3所示的引物对、利用PCR技术扩增FXYD6胞内区基因后，将扩增出的FXYD6胞内区基因插入到已用BamH I和Xho I双酶切后的表达载体pGEX_6P_l中，所得到的重组载体。一种可在宿主细胞中表达FXYD6胞内区蛋白的重组载体，其核苷酸序列如SEQ IDNo 4所示。一种含有如上所述的重组载体的宿主细胞。如上所述的宿主细胞，其优选为原核细胞。如上所述的宿主细胞，其优选为大肠杆菌。本发明的有益效果为本发明提供了 FXYD6胞内区的纯化蛋白，进一步可应用于制备FXYD6蛋白胞内区的单克隆抗体。制备的FXYD6单克隆抗体可以应用于免疫组化、Western Blot、ELISA等实验，这样就为进一步研究FXYD6组织分布提供了有利工具，也可以用FXYD6单克隆抗体通过免疫印迹和免疫沉淀来研究FXYD6与其它蛋白相互作用情况。
图I为原核质粒pGEX-6P-l的表达载体图谱。图2为重组质粒pGEX-6P-l-FXYD6胞内区的PCR鉴定结果。图3为FXYD6胞内区重组蛋白表达的SDS-PAGE分析结果。图4为FXYD6胞内区重组蛋白表达的Western Blot检测结果。图5为纯化后的FXYD6胞内区重组蛋白的SDS-PAGE分析结果。
具体实施例方式一、实验材料UTaq DNA聚合酶、限制性内切酶BamH I、Xho I和T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)2、FXYD6全长cDNA序列(武汉三鹰生物技术有限公司)3、克隆质粒载体 pMDl8_T Simple Simple (TaKaRa 公司)
4、表达质粒载体 pGEX_6P_l (TaKaRa 公司)5、质粒提取试剂盒(TaKaRa公司)6、克隆宿主大肠杆菌Trans 10、表达宿主大肠杆菌BL21 (TaKaRa公司)7、鼠抗GST标签单克隆抗体(HaiGene公司)8、GST融合蛋白亲合层析柱(Sigma公司)9、HRP (辣根过氧化物酶)标记羊抗小鼠IgG(北京经纬博恒生物科技开发有限责任公司)KKWestern Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒(北京康为世纪生物有限公司)二、实验方法I、引物设计与合成FXYD6蛋白的开放阅读框cDNA序列如序列表SEQ ID No : I所示，其中，169-288位核苷酸序列为胞内区序列。参考如图I所示的原核质粒PGEX-6P-1的图谱，为方便克隆且保证目的基因片段以一个方向插入质粒中，克隆FXYD6胞内区序列，并在克隆的同时，在其上下游分别添加BamH I和Xho I酶切位点，此位点为质粒pGEX_6P_l所带有。为实现上述目的，设计以下一对引物上游引物Pl(SEQ ID No. 2) :5' -ggatccctaa gtcgcaggtg caag-31 ,其中 ggatcc为BamH I酶切位点；下游引物P2 (SEQ ID No. 3) 5 1 -ctcgagtcag ttctctgctt tctgg-3 1，其中ctcgag为Xho I酶切位点。2、目的基因的扩增(I)PCR反应体系如表I所示。表IPCR 反应体系(50 μ L)
序号成分各成分用量
1FXYD6 cDNA2\ ,
2Pl2\ ,
3P22\ ,
4IOxbuffer5pL
52.5mM dNTPSμL
6DNATaqIpL
7ddH203 (^L(2)PCR反应条件的设置如表2所示。表2PCR反应条件的设置
权利要求
1.一种FXYD6胞内区蛋白的表达和纯化的方法，其特征在于，步骤如下 a.采用核苷酸序列如SEQID No :2和SEQ ID No :3所示的引物对，利用PCR技术扩增FXYD6胞内区基因； b.将扩增出的FXYD6胞内区基因插入到已用BamHI和Xho I双酶切后的表达载体PGEX-6P-1中，构建重组载体pGEX-6P-l-FXYD6胞内区； c.将重组载体PGEX-6P-1-FXYD6胞内区转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达FXYD6胞内区蛋白； d.表达的FXYD6胞内区蛋白采用蛋白质免疫印记进行鉴定，之后通过亲和层析柱进行纯化，经过纯化的蛋白再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定纯度。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
4.一对用于FXYD6胞内区蛋白的表达和纯化的引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :2所示,下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示。
5.—种可在宿主细胞中表达FXYD6胞内区蛋白的重组载体，其特征在于，其是采用核苷酸序列如SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示的引物对、利用PCR技术扩增FXYD6胞内区基因后，将扩增出的FXYD6胞内区基因插入到已用BamH I和Xho I双酶切后的表达载体PGEX-6P-1中，所得到的重组载体。
6.一种可在宿主细胞中表达FXYD6胞内区蛋白的重组载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No 4所示。
7.一种含有权利要求5或6所述的重组载体的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种FXYD6胞内区蛋白的表达和纯化的方法，是采用核苷酸序列如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示的引物对、利用PCR技术扩增FXYD6胞内区序列后，将扩增出的FXYD6胞内区序列插入到表达载体pGEX-6P-1中，构建重组载体pGEX-6P-1-FXYD6胞内区；再将重组载体转化于宿主细胞中，并在宿主细胞中表达FXYD6胞内区重组蛋白；表达的重组蛋白进行鉴定后，通过亲和层析柱进行纯化，经过纯化的蛋白再通过SDS-PAGE分析鉴定纯度。本发明提供了FXYD6胞内区的纯化蛋白，进一步可应用于制备FXYD6蛋白胞内区的单克隆抗体。为进一步研究FXYD6组织分布提供了有利工具。
文档编号C12N15/11GK102978210SQ201110259079
公开日2013年3月20日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者周宁新 申请人:周宁新