专利名称：用于预测尿道下裂易感性的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预测疾病易感性的基因芯片，具体讲是一种用于预测尿道下裂易感性的基因芯片。
背景技术：
尿道下裂是睾丸发育不全综合症的一种，它是男性泌尿生殖系统最常见的畸形之一，因为尿道褶不完全融合或尿道融合的发育停止，导致尿道沿阴茎腹侧异常开裂，尿道开裂部位可能位于阴茎头部、阴茎甚至阴囊或会阴的更后端，它属于常见的阴茎先天性发育不全。尿道下裂的发病率在不同国家和人种之间各有不同，但总体来说在全世界范围内均呈上升趋势，目前亚洲、欧洲和北美的男婴患病率介于0.3%和0.8%之间。近年来，随着外科技术和器械的进步，对于尿道下裂的治疗也有明显进展。虽然大多数患有此症的儿童在出生后可进行尿道修复手术，但是在以后的生活中患者仍有可能遇上一系列社会和生殖问题，因此人们对尿道下裂的发病原因也更加关注。目前的研究仍然无法对尿道下裂的病因学作清晰的阐述，从大量的调查数据来看，中早期的尿道下裂均表现为家族性疾病，这揭示了尿道下裂的病因学研究中遗传性因素的重要性。研究人员试图从分子水平解释此类先天性发育畸形疾病的发生，以便从其发生之始便进行干预。尿道下裂可能与隐睾在病因上存在共同的致病因素，临床上一般认为尿道下裂是性别分化和发育异常综合症的一种表现，是一种不同程度的性别发育畸形。总体上来说，尿道下裂是一种经遗传和环境因素等多因子影响的先天性身体机能紊乱。男性泌尿生殖系统的发育是一个综合过程，包括遗传编码、细胞分化、旁分泌和自分泌调节的激素信号传导、酶活性和按预定顺序进行的组织重塑等，这些过程都以时间和浓度依赖的方式发生。其中，雄激素和雌激素之间的平衡对于男性生殖系统的正常发育尤为重要。男婴尿道和外部生殖系统的发育是一个雄激素依赖的过程，雄激素的合成和代谢异常可能会导致异常的生殖系统发育。阴茎的完整器官形成大约在胚胎第46周完成，它不仅受到胎儿睾丸发育的影响， 也受胎盘促性腺激素的调控，胎儿睾丸发育不全、雄激素作用失调所导致的尿道沟不能闭合是尿道下裂产生的原因。男婴外部生殖器官正常表型的发育需要这些器官组织的原始细胞内睾酮(T)和二氢睾酮(DHT)之间的转化。其中17 β-羟类固醇脱氢酶3(17 β HSD3，由 HSD17B3编码)和类固醇5 α -还原酶II (由SRD5A2编码)与此类雄激素的合成和代谢相关。HSD17B3基因位于染色体9q22上，它包括11个外显子。在睾丸内，17 β HSD3同工酶催化C19-类固醇雄留烯二酮转化为生物学活性更大的雄激素睾酮(T)。17 β HSD3的异常会导致睾酮分泌水平或者生物活性的改变，从而影响睾丸的功能。HSD17B3基因的多个SNP (单核苷酸多态性)位点与尿道下裂有关，尿道下裂可能由HSD17B3基因的突变引起，导致男婴体内17i3HSD3同工酶存在缺陷，进而影响睾酮的分泌量和生物活性。SRD5A2基因位于染色体2p23上，长约1401Λ，包含5个外显子和4个内含子。它编码的类固醇5 α -还原酶II为含有259个氨基酸的疏水蛋白，与男性性别分化相关。类固醇5 α -还原酶II将外周靶组织分泌的雄激素睾酮(T)转变为二氢睾酮(DHT)，二氢睾酮(DHT)进一步刺激阴茎完整器官的形成。而SRD5A2的多态性变异体影响了 5 α -还原酶 II的活性，至今发现该基因近30种突变，包括碱基缺失、点突变、移码突变等，最多见的突变位点是第4外显子，其次是第1、5外显子。突变基因编码的酶活性下降，导致对底物雄激素亲和力下降和二氢睾酮的水平不足，可能导致尿道下裂等缺陷。此外，在胎儿期、围产期母体及胎儿环境外源性雌激素物质暴露增加可能干扰了正常的内分泌功能，影响睾丸间质细胞(Leydig cells)及支持细胞(Sertoli cells)的发育，从而也会导致了尿道下裂发生率的增高。导致尿道下裂发病的外源性雌激素效应与外源性雌激素的量、性质、作用时期及基因易感性有关。外源性雌激素通过雌激素受体其作用，因此基因易感性主要由雌激素受体的易感性决定，从根本上来说雌激素受体基因的多态性决定了其对雌激素相关疾病的易感性。雌激素受体α基因(即ESRl基因)、雌激素受体β基因(即ESR2基因)和活性转录因子3基因(即ATF3基因)都是调节外源性雌激素作用的重要基因，在人尿道下裂组织中表达水平明显上调。ESRl基因位于第6号染色体上，由8个外显子和7个内含子组成，长约四5吐，它编码含有595个氨基酸的蛋白质雌激素受体α (ERa )，ERa的分子量约为66kD。ESR2基因位于14号染色体上，长约1111Λ，它编码含有485个氨基酸的蛋白质雌激素受体β (ER^), ER^的分子量约为M.3kD。雌激素与ERa或偶联，提高雌激素受体的信号传导，激活雌激素应答基因。而过量的雌激素效应可以抑制脑垂体促性腺激素的产生和雄激素的分泌，而雄激素对睾丸发育和尿道形成有重要促进作用，因此雌激素受体的大量表达，使得在外源性激素作用下，尿道下裂更易发生。雌激素受体基因存在多态性和变异，且多态性多为功能性，不同的雌激素受体等位基因型有可能决定不同个体间雌激素受体的表达水平和功能，进而影响雌激素受体调节基因表达和雌激素受体信号传导途径中各种因子的生物学作用。ATF3基因编码活性转录因子3 (ATF!3)，是一种雌激素应答基因，它编码的ATF3是含亮氨酸拉链结构的转录因子ATF/CREB家族成员，分子量为21kD。该基因在大部分正常细胞中呈低浓度稳态表达，广泛参与机体稳态维持、创伤愈合、细胞黏附、肿瘤形成、凋亡以及信号传导等生理和病理过程。该基因的启动子含有雌激素结合点，可被雌激素激活，存在多态性和变异，在尿道下裂组织中表达水平明显上调。此外，尿道下裂的发病机理可能还包括其他许多致病因素，例如DGKK基因的多个 SNP位点突变也是将近三分之一的尿道下裂病例的致病因素之一。DGKK基因位于X染色体上，该基因含有20个多态性位点，大部分SNP位点相互之间为稳定的连锁不平衡状态。DGKK 基因编码人类II型甘油二酯激酶κ，甘油二酯激酶调节两种信号类脂——甘油二酯和磷脂酸之间的平衡，因而在信号转导中起重要作用。DGKK mRNA在睾丸和胎盘中最为富集，而带有风险等位基因的患者的包皮皮肤组织中，DGKK的表达水平有所下调。尿道下裂的发生是一个非常复杂的过程，受到多个蛋白和基因的共同影响，不同的易感基因之间可能存在相互作用。其中任何一个酶的改变都可能影响疾病的易感性，某一易感基因对尿道下裂的影响可能会由于其他基因的作用而改变。如果同时对多种易感基因的多个SNP位点进行分析，则有助于阐明各种易感基因之间的相互作用机制及其对尿道下裂的影响。传统的基因检测疾病的方法受到方法和思路的限制，往往只能对一到两个基因的多态性进行分析，只能覆盖一部分患病风险人群，对由于其他基因上的SNP位点造成的疾病患病风险不能及时预警，检测准确性因此会大幅降低，无法较为全面的检测疾病的易感情况。目前国内外尚未有对尿道下裂的多个易感基因的多个SNP位点进行同时检测的基因芯片，一般检测疾病的易感性均采用直接测序法，虽然准确率较高，但是其成本高、无法批量检测，不能满足大规模基因筛选的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，此基因芯片可确立SNP模式和尿道下裂易感性的对应关系，迅速便捷地对普通人群进行筛查，准确率高，成本较低，可用于批量检测，能充分满足大规模基因筛选的要求。为解决上述技术问题，本发明用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，它包括以 DGKK、ESRl、ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3基因为检测位点的寡核苷酸探针和对应的特异性引物，所述特异性引物的5’端预先均用信号物质进行标记。作为优选，所述寡核苷酸探针是针对DGKK基因的rsl934177位点，ESRl基因的 rs693^02 位点、rs9340799 位点和 rs2234693 位点，ESR2 基因的 rs2987983 位点、rsl0483774位点和rs944050位点，ATF3基因的rsl 1119982位点，SRD5A2基因的 rsl21434251 位点、rs523349 位点、rs9282858 位点和 rs28383048 位点，HSD17B3 基因的 rs2066479位点而设计，所述特异性引物能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段。作为进一步优选，所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO. 1-N0. 104所示的核苷酸序列。作为进一步优选，所述特异性引物具有SEQ ID NO. 105-N0. 1 所示的核苷酸序列。作为优选，所述特异性引物的5’端预先均用荧光素、同位素、生物素或地高辛进行标记。作为优选，所述基因芯片还包括固相载体，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质，所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基，所述玻璃基质的化学基团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。作为改进，所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。作为改进，所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。作为进一步改进，所述基因芯片还包括DNA取样试剂、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂。本发明的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片的使用方法为(1)使用所述DNA取样试剂提取患者DNA ;(幻使用所述特异性引物和所述PCR扩增试剂扩增包括目标SNP位点的DNA片段；C3)将同一样本的各个PCR扩增产物混合，加入杂交液后与所述芯片杂交； (4)使用扫描仪扫描杂交信号。上述技术方案中的DNA提取、PCR扩增、PCR产物纯化和基因芯片等均为常规的分子生物学技术。基因芯片技术是近年迅速发展起来的一项前沿分子生物学技术，它又被称为DNA 芯片或DNA微阵列，是生物芯片的一种。它通过与计算机图像分析的有机结合，在一次实验中可对样品中靶分子的质量或数量进行快速、准确、高效的检测。具体来说，基因芯片是指将大量人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸片段作为探针，所述探针包含特定的核苷酸序列，采用微量点样等方法，使所述探针按照特定的排列方式和特定的手段固化于支持物(如玻片、硅片、塑料片、聚丙烯酰胺凝胶篇或尼龙膜等载体)的表面，形成密集二维分子排列。然后与已标记的待测生物样品中靶分子进行杂交，通过特定的扫描仪如光学扫描仪、激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影相机(CCD)对杂交信号进行快速、并行、高效地分析，从而判断样品中靶分子的数量和质量。本发明的芯片中包含与尿道下裂易感性检测相关的目的基因和用于质控的基因，基因芯片的结构以及制造方法可以参阅CN 2457166A、CN1341752A、CN1616178A、 US5445934、US5532U8等公开的方法，可方便地根据使用者的要求制出所需芯片，所述基因芯片的制作步骤简洁方便、成本较低。PCR (即聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)是最常用的分子生物学技术之一，是由体外酶催化扩增特异DNA的一种方法。典型的PCR —般包括高温使模板DNA 变性、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成的循环，经过上述多次循环反应，使目的DNA得以迅速大量扩增。本发明的寡核苷酸探针根据尿道下裂相关基因的各SNP位点和侧翼序列设计，针对每个SNP位点，正反2条DNA链共设计8条探针；然后再根据SNP位点两端的更远侧翼序列设计用于PCR扩增的上下游引物，对每对引物之一的5’端预先进行信号标记，所述标记优选为荧光标记、同位素标记、生物素标记或地高辛标记。本领域技术人员可以通过本领域常规方法进行探针合成，并进行氨基修饰或信号标记，然后提取待检测样品的DNA，用针对每个待检测SNP位点设计的上下游引物对进行 PCR扩增，使得微量待检测样品的DNA大量扩增，并在扩增过程中引入荧光标记等信号标记。扩增后含有信号标记物的待测样品核酸靶分子通过碱基互补配对原则与芯片上的寡核苷酸探针杂交，此后进行芯片扫描，获得每个位点的信号，对杂交信号强弱和有无进行分析，即可判断样品中靶基因的数量和性质。本发明采用PCR扩增和基因芯片相结合的技术， 使得检测的灵敏度高、通量大。上述DNA提取试剂、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、杂交试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在基因芯片试剂中，也可以将其配方列在基因芯片试剂的说明书中，由使用者按照说明书中的指示自行配制。因此，本发明的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，与现有技术相比，具有以下优点
(1)设计了检测尿道下裂易感性的基因芯片系统，确立SNP模式和尿道下裂易感性的对应关系；(2)针对尿道下裂不同的患病途径检测多个相关的基因及其多态性位点，能更准确全面地预测受检者不同患病途径的患病风险，可迅速便捷地对普通人群进行筛查，在疾病发生早期就预测出尿道下裂易感性，从而通过各种治疗方法尽早干预，减轻甚至消除尿道下裂对儿童的不良影响；(3)准确率高，成本较低，可用于批量检测，能充分满足大规模基因筛选的要求；(4)芯片制作的步骤简洁方便，检测灵敏度高，通量大。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的内容并不局限于以下实施例，相同领域的技术人员可以在本发明的技术方案框架内提出其他的实施例，但这些实施例均包括在本发明的保护范围内。下列实施例中未注明具体条件的实施放大，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。本发明用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，它包括以DGKK、ESRU ESR2、ATF3、 SRD5A2、HSD17B3基因为检测位点的寡核苷酸探针和对应的特异性引物，所述特异性引物的 5’端预先均用信号物质进行标记。作为优选，所述寡核苷酸探针是针对DGKK基因的rsl934177位点，ESRl基因的 rs693^02 位点、rs9340799 位点和 rs2234693 位点，ESR2 基因的 rs2987983 位点、rsl0483774位点和rs944050位点，ATF3基因的rsl 1119982位点，SRD5A2基因的 rsl21434251 位点、rs523349 位点、rs9282858 位点和 rs28383048 位点，HSD17B3 基因的 rs2066479位点而设计，所述特异性引物能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段。作为进一步优选，所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO. 14-N0. 117所示的核苷酸序列。作为进一步优选，所述特异性引物具有SEQ ID NO. 118-N0. 139所示的核苷酸序列。作为优选，所述特异性引物的5’端预先均用荧光素、同位素、生物素或地高辛进行标记。作为优选，所述基因芯片还包括固相载体，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质，所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基，所述玻璃基质的化学基团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。作为改进，所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。作为改进，所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。作为进一步改进，所述基因芯片还包括DNA取样试剂、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂。本发明的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片的使用方法为(1)使用所述DNA 取样试剂提取患者DNA ;(幻使用所述特异性引物和所述PCR扩增试剂扩增包括目标SNP位点的DNA片段；C3)将同一样本的各个PCR扩增产物混合，加入杂交液后与所述芯片杂交；(4)使用扫描仪扫描杂交信号。本实施例选取与尿道下裂易感性相关的DGKK、ESR1、ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3 基因上的13个SNP位点，根据这13个SNP位点及其侧翼序列设计寡核苷酸探针和对应的特异性引物，针对每个SNP位点设计4对寡核苷酸探针，即正反两条DNA链共设计8条寡核苷酸探针。有两对特异性引物可扩增出同时包括上述两个SNP位点在内的DNA片段，因此共设计了 11对特异性引物，可扩增出包括上述13个SNP位点在内的DNA片段。具体来说，基因芯片的制备方法可按照如下步骤进行原料准备——醛基芯片(高分子三维基片D，厂商Capitalbio，规格为75. 5*25. 2*1. 0)基因芯片点样液(Capitalbio，5ml)或2*Spoting Solution 等1、寡核苷酸探针序列设计如序列表所述，按照本领域技术人员熟知的方法合成5’ 端氨基标记探针，所述寡核苷酸探针与各SNP位点的对应关系如下所示
权利要求
1.一种用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于它包括以DGKK、ESRU ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3基因为检测位点的寡核苷酸探针和对应的特异性引物，，所述特异性引物的5’端预先均用信号物质进行标记。
2.根据权利要求1所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探针是针对DGKK基因的rsl934177位点，ESRl基因的rs693^02位点、rs9340799 位点和rs2234693位点，ESR2基因的rs2987983位点、rsl0483774位点和rs944050位点， ATF3 基因的 rsl 1119982 位点，SRD5A2 基因的 rsl21434251 位点、rs523349 位点、位点和rd8383048位点，HSD17B3基因的rs2066479位点而设计，所述特异性引物能特异性扩增出包括上述SNP位点的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO. 1-N0. 104所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述特异性引物具有SEQ ID NO. 105-N0. 1 所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述特异性引物的5’端预先均用荧光素、同位素、生物素或地高辛进行标记。
6.根据权利要求1-4任一项所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括固相载体，所述固相载体为经过表面化学基团修饰的玻璃基质，所述寡核苷酸探针的末端带有修饰氨基，所述玻璃基质的化学基团可与寡核苷酸探针的修饰氨基共价结合。
7.根据权利要求1-4任一项所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括一个阴性对照样本和一个阳性对照样本。
8.根据权利要求1-4任一项所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括杂交盒和杂交液。
9.根据权利要求8所述的用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，其特征在于所述基因芯片还包括DNA取样试剂、PCR扩增试剂和PCR产物纯化试剂。
10.一种权利要求9所述的基因芯片的使用方法，其特征在于所述方法为(1)使用所述DNA取样试剂提取患者DNA ;(幻使用所述特异性引物和所述PCR扩增试剂扩增包括目标 SNP位点的DNA片段；(3)将同一样本的各个PCR扩增产物混合，加入杂交液后与所述芯片杂交；(4)使用扫描仪扫描杂交信号。
全文摘要
本发明公开了一种用于预测尿道下裂易感性的基因芯片，它包括以DGKK、ESR1、ESR2、ATF3、SRD5A2、HSD17B3基因为检测位点的寡核苷酸探针和对应的特异性引物，所述特异性引物的5’端预先均用信号物质进行标记。本发明的基因芯片可确立SNP模式和尿道下裂易感性的对应关系，迅速便捷地对普通人群进行筛查，准确率高，成本较低，可用于批量检测，能充分满足大规模基因筛选的要求。
文档编号C12Q1/68GK102417926SQ20111027534
公开日2012年4月18日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者孙早, 徐珊, 王海勇, 符伟红, 金涛, 陈艳丽 申请人:杭州博泰基因技术有限公司