专利名称：一种携带attB高效定向整合假attP位点的载体及其转基因方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种携带attB序列高效定向整合基因组中假attP位点的载体及其转基因方法。
背景技术：
科学家们发展了多种转基因技术，以提高转基因动物的生产效率。但目前在大动物中转基因的整合率和表达率均不甚理想。当前国际通用的转基因方法是显微注射法，成本较高而成功率很低。就转基因动物-乳腺生物反应器而言，其成功率仅3%左右。显微注射导致外源基因在染色体上随机整合，转基因的表达极大地受周围宿主基因组的影响。因此，发展外源基因的高效定点整合技术，提高外源基因在转基因动物体内的表达水平，即建立安全、高效以及操作简单的转基因家畜制备技术是解决上述问题的关键。最近，链霉菌噬菌体Φ031整合酶(phiC31 integrase)开始成为基因修饰研究中的有力工具。Cre、FLP和β等重组酶在同一靶位点既整合又剪切，因此，它们介导的净整合率很低。与这些酶不同的是，链霉菌噬菌体ΦC31整合酶在其靶位点仅仅执行整合反应， 而由其介导的剪切反应需要附加因子才能完成(参见Thorpe HM. , Smith MC. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 1998,95(10) :5505-10)；因此在没有附加因子存在的情况下，其净整合率较高。这使6C31整合酶成为一个有吸引力的位点特异整合的候选酶。链霉菌噬菌体Φ C31整合酶所识别的att位点结构比较简单，attB和attP重叠区只有约:3bp的相同序列(TTG)，侧翼是两个反向重复序列。通过将长短不同的attP位点和attB位点装入载体中，考察整合酶催化这两个位点同源重组的效率，最终确定出整合酶所识别的attP和attB最短序列分别为39bp和34bp，称为核心序列。其attP位点核心的 39bp 序列为 ccccaactggggtaacctTTGagttctctcagttggggg, attB 位点核心的 34bp 序列为 gtgccagggcgtgcccTTGggctccccgggcgcg(参见 Groth A. C. , Olivares E. C. , Thyagarajan B. and Calos Μ. P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 97 (2000) :5995-6000)。除了 attP位点外，链霉菌噬菌体ΦC31整合酶还可催化attB位点和一些基因组中某些位点的整合，这些位点的核心序列与噬菌体attP位点的核心序列有一定的同源性， 具有类似的功能，因此称为“假attP位点”。现已证实链霉菌噬菌体Φ031的整合酶在人类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞和果蝇细胞中均能有效地介导外源DNA的位点特异性整合(参见 Groth AC. ,Olivares EC. ,Thyagarajan B.，Calos MP. Proc Natl Acad Sci USA,97 (2000) 5995-6000 ；Thyagarajan B. ,Olivares EC. ,Hollis RP. Ginsburg DS. Calos MP. Mol Cell Biol, 21 (2001) :3926-34 ；Chalberg, Τ. W.，Genise, H. L.，Vollrath, D. Calos, Μ. P. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , 46 (2005), 2140-2146 ；Groth AC. ， Fish Μ. ， Nusse R. and Calos MP. Genetics, 166 (2004) : 1775-1782)。这些整合主要发生在一些热点位点(或称为优选位点)，亦即基因组中所谓的“假attP位点”。噬菌体整合酶催化含attB位点的DNA片段在这些位点的整合效率是随机整合的5-10倍。而且，有实验表明，在小鼠体内，6C31整合酶介导的凝血因子IX(FIX)基因以位点特异性方式整合后，其表达水平是以慢病毒载体介导的基因转移后表达水平的20 倍(参见 Olivares EC.，Hollis RP.，Chalberg Tff.，Meuse L.，Kay MA.，Calos MP. Nat Biotechnol.20(2002) :1124-1128) 0 Φ031整合酶以单向整合方式，重组过程无须其他辅助因子，而且整合率高等特点，所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合，用于基因治疗和转基因研究。相对于Cre、FLP和β等重组酶，虽然ΦC31整合酶的整合过程不需添加附加因子也不会导致恢复剪切，但是6C31整合酶的效率不高，相对于随机整合仅提高2. 1倍，因此 Φ031整合酶系统的应用受到了很大的制约。为提高ΦC31整合酶系统的效率的和特异性整合，一些研究通过在整合酶中加入核定位信号，筛选突变整合酶提高了整合效率。还有一些研究与功能基因方向相反插入的 attB，在整合酶的作用下提高了整合酶系统的效率。但是这些方法所得整合酶系统的效率还有待进一步提高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对Φ031整合酶效率不高的不足，提供一种携带attB序列高效定向整合基因组中假attP位点的载体及其转基因方法。本发明的第一方面提供一种携带attB序列高效率定向整合基因组假attP位点的载体，该载体含有两个或者两个以上互相间隔的attB序列。优选的，该载体含有两个或者三个attB序列。优选的，该载体中相邻的两个attB序列之间的间隔是300bp以上的序列长度。优选的，该载体中attB的方向是正向或者反向。优选的，该载体的出发载体是质粒pEGFP-Nl。所述的attB的序列优选如SEQ ID NO 1所示。所述的attB也可以是attB核心序列，即如SEQ ID NO 1所示序列的第46位到第79位。优选的，该载体是attB分别在载体pEGFP-attB-Nl的Eco0109I位点、 AseI位点和PciI位点中的一个或多个插入获得的。更优选携带2个attB的载体，pattBP-EGFP-attB-Nl, pattBA_EGFP_attB_Nl，pattBPA_EGFP_attB_Nl 及 pattBE-EGFP-attB-Nl，或者携带 3 个 attB 的载体，pattB-attB_EGFP-attB_Nl。本发明的第二方面提供一种利用噬菌体Φ031整合酶系统转基因方法，包括将含有attB序列的携带外源基因的载体和表达Φ C31整合酶的载体共转染宿主细胞，其中所述的含有attB序列的携带外源基因的载体中含有的两个或两个以上互相间隔的attB序列。所述的宿主细胞优选真核细胞，更优选人细胞、牛细胞或者羊细胞。所述的表达Φ031整合酶的载体与含有attB序列的携带外源基因的载体的转染比例优选1 1 1 50更优选1 10。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。本发明的积极进步效果在于，在Φ031整合酶系统介导的定点整合中，通过在载体中增加间隔attB的数目，有效提高了整合酶系统的整合效率，实现外源基因的高效整合和表达。在整合酶作用下含2个和3个attB位点的pattB-EGFP-attB-Nl和pattB-attB-EGFP-attB-Nl 比含有 1 个 attB 位点的 pEGFP_attB_Nl 整合率分别提高了 2. 8 和2. 2倍，比不含整合酶的随机整合则分别提高了 14. 5和12倍多。本发明通过在载体中控制attB的数目来调节整合酶的效率，是一种省时省力的方法。本发明促进了整合酶系统在基因治疗和转基因动物领域的进一步应用。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是pattB-EGFP-attB-Nl酶切鉴定电泳图泳道M为1Kb DNA Marker ；泳道1 为质粒 pattB-EGFP-attB-Nl ；泳道 2 为 Eco0109I 酶切 pattB-EGFP-attB-Nl。图 2 是 pattB-attB-EGFP-attB-Nl 酶切鉴定电泳图泳道 M 为 1Kb DNA Marker ；泳道 1 为 pattB-attB-EGFP-attB-Nl ；泳道 2 为 AseI，PciI 双酶切鉴定 pattB-attB-EGFP-attB-Nl。图3是载体酶切鉴定电泳图。泳道1，2为PciI酶切pattBP-EGFP-attB-Nl ； 泳道 3，4 为 AseI 酶切 pattBA-EGFP-attB-m ；泳道 5，6 分别为 Pcil，AseI 酶切 pattBPA-EGFP-attB-Nl 泳道 7，8 为 Eco0109I 酶切 pattBE-EGFP-attB-Nl ；泳道 M 为 IOObp markerο图4是质粒构建图。图5显示整合酶系统比例与效率之间的关系。图6显示整合酶系统比例与H2AX表达水平的关系。C组对照 (50ngpEGFP-attB-Nl and 2000ng pcDNA3. l/Zeo(+)) ；B 组空白(不转染)。图7显示载体内不同位置的attB对整合效率的影响。 图8是四组质粒经1 ipfectamindOOO转染HeLa细胞后，第二天加筛选药物 G418 (Promega公司)，使其浓度为400μ g/ml。筛选14天，至阴性细胞全部死亡，转染细胞中的阳性克隆逐渐长出。用含有亚甲基蓝的70%酒精染色10分钟，在去离子水中过夜， 自然干燥后。图9是四组质粒经IipfectamindOOO转染HeLa细胞后，第二天收集细胞计数并通过FACS测定转染率，加筛选药物G418 (Promega公司)，使其浓度为400 μ g/ml。筛选14 天，用含有亚甲基蓝的70%酒精染色10分钟，在去离子水中过夜，自然干燥后计数算出
整合率。图10四组质粒经IipfectamindOOO转染HeLa细胞后，第二天收集细胞计数并通过FACS测定转染率，根据FACS的转染效率和细胞的数目，将四组细胞按照一定的比例分别铺入6孔板中，使得每孔的初始EGFP表达水平相当；根据FACS的转染效率和细胞的数目， 将四组细胞按照一定的比例分别铺入6孔板中，使得每孔的初始EGFP表达水平相当；3天后收集细胞进行FACS测定的测定结果。
具体实施例方式本发明人经过大量的研究和反复的试验，发现在Φ C31整合酶系统中增加attB的数目能够显著提高整合酶的效率。为此，本发明人构建了含有多个attB序列及外源基因的载体，将构建好的载体与整合酶载体混合后转染宿主细胞，检测转染率，发现含有多个attB的载体具有更高的整合效率和外源基因的表达量。携带attB的载体本发明提供了一种含有attB序列定向整合基因组假attP位点的载体。其中含有两个或者两个以上互相间隔的attB序列。较佳的含有两个或者三个attB序列。也可以含有三个以上的attB序列，本发明并不限制。相邻的两个attB序列之间具有一定的间隔，较佳的间隔300bp以上的序列长度。本发明对最长间隔的距离并不限制，只要该载体可以承受即可。attB的方向本发明也不限制。正向和反向都可以实现本发明的目的。attB序列在载体中的位置、和外源基因的位置关系等本发明也不限制，只要该载体中的各个功能元件能够正常工作即可，如attB序列的插入位置不会导致外源基因的中断，导致不能正常表达即可。本发明中所述的含有attB序列定向整合基因组假attP位点的载体，可以是本领域的现有载体，比如宿主细胞是真核细胞的各种载体，商业质粒等，较佳的如质粒 pEGFP-attB-Nl。所述的载体的出发载体较佳的是质粒pEGFP-Nl。本发明中所述的attB的序列可以是已知的噬菌体attB位点序列，较佳的是SEQ ID NO :1所示。也可以是attB的核心序列。该attB的核心序列较佳的为SEQ ID NO 1的第46位到第79位。同样的插入的相邻attB核心序列相距300bp以上，每个attB与整合酶的结合才不会互相干扰。 本发明中，所述的“以上”是指包括本数。本发明一较佳的实施例是将attB分别插入到载体pEGFP-attB-Nl (参见中国专禾Ij 200510111476. 3)的Eco0109I位点和AseI与PciI位点之间，获得携带2 个 attB (pattBP-EGFP-attB-Nl, pattBA_EGFP_attB_Nl，pattBPA_EGFP_attB_Nl 及 pattBE-EGFP-attB-Nl)和 3 个 attB 的载体(pattB-attB-EGFP-attB-Nl)。Φ C31整合酶介导的转基因方法本发明还提供了一种利用噬菌体Φ031整合酶系统转基因方法，包括将含有attB 序列的携带外源基因的载体和表达6C31整合酶的载体共转染宿主细胞，其中，所述的含有attB序列的携带外源基因的载体中含有的两个或两个以上互相间隔的attB序列。质粒pEGFP-attB-Nl，也称为 pEGFP_Nl_attB，参见中国专利 200510111476. 3。本发明引用中国专利200510111476. 3全文。本发明中所述的利用噬菌体Φ031整合酶系统转基因方法是已知的方法，将含有 attB序列的携带外源基因的载体和表达ΦC31整合酶的载体共转染宿主细胞。其中，携带外源基因的载体的含有的attB序列和宿主细胞基因组中的假attP位点具有同源性。而 Φ031整合酶可以识别并催化attB和attP的同源重组。表达Φ031整合酶的载体表达出 Φ C31整合酶，使该同源重组发生，从而将载体携带的外源基因重组进入宿主细胞的基因组中。本发明中所述的表达Φ031整合酶的载体可以是现有技术中的已知载体。本发明中所述的宿主细胞可以是任何细胞，只要载体能够导入即可，一般是真核细胞。优选的如人细胞、牛细胞、羊细胞。本发明对表达Φ031整合酶的载体与含有attB序列的携带外源基因的载体的转染比例(1 1 1 50)的比例进行了摸索，结果发现随着整合酶载体的增加，整合效率不断提高。但是相应的随着整合酶载体的不断增加，H2AX (反应DNA链损伤的一种标志物) 表达水平也在不断升高。因此整合酶载体与携带attB及外源基因的载体比例应该控制在一定范围之内，既可实现高效整合也要兼顾安全性问题，本发明中优选的比例为1 10。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。图4是实施例中的载体构建图。实施例1 构建载体 pattBP-EGFP-attB-Nl， pattBA-EGFP-attB-Nl 及 pattBPA-EGFP-attB-Nl一、获得attB片段从质粒pBCPB (即pBCPB+，参见中国专利200510111476. 3)中获得attB，连接至质粒PMD-19T中，以Eco0109I酶切，回收310bp的酶切片段。1)以质粒pBCPB+为模板，用PCR方法扩增attB。引物序列为
引物引物序列Pl5'-AGTAAC ATGTTCGAGGTCGACGATGTAGGT-3 ‘P25'-AGTAAC ATGT GAGGGGCCC AAGCTT-3 ‘Al5 '-AGTACTTAAGAACCGTATTACCGCC ATGCAT-3 ‘A25AGTACTTAAGACCCC GTAATTGATTACTAT-3 ‘PAl5'-AGTAACATGTTCGAGGTCGACGATGTAGGT-3'PA25 '-AGTACTTAAGACCCC GTAATTGATTACTAT-3 ‘以pBCPB+为模板，若以P1，P2为引物(引物携带PciI酶切位点)，扩增出PCR产物中携带PciI位点；以A1，A2为引物，扩增出PCR产物中携带AseI位点；以PA1，PA2为引物，扩增出PCR产物中5’和3’分别携带PciI和AseI位点。PCR反应体系IXPCR缓冲溶液(TaKafci 公司)，1. 5mM Mg2+，引物各 10 μ M，200 μ M dNTPs，模板 DNA 100 200ng，2. 5U Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)。PCR 反应条件94 "C 5min ；94 "C Imin, 62 "C Imin, 72 "C 3min，30 个循环； 720C IOmin。2)以凝胶回收试剂盒(北京天根生物技术公司，凝胶回收纯化试剂盒)纯化所得的3 IObp的PCR产物，操作步骤按产品说明书进行。3)取纯化产物5μ 1，连接至质粒pMD-19T(Takara公司)中，连接条件为纯化产物 5μ 1，PMD-19T 载体 1μ 1，5μ 1 solution I (Takara 公司)，总反应体积 10 μ 1。16°C 过夜。4)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化子扩增培养，提取质粒。所得质粒分别命名为PMD-19PB，PMD-19AB和PMD-19PAB。分别以Pci I和AseI酶切。酶切反应体系为
权利要求
1.一种携带attB序列高效率定向整合基因组假attP位点的载体，其特征在于，该载体含有两个或者两个以上互相间隔的attB序列。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体中相邻的两个attB序列之间的间隔是300bp以上的序列长度。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体中attB的方向是正向或者反向。
4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体的出发载体是质粒PEGFP-N1。
5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的attB的序列是SEQIDNO :1所示，或者是attB核心序列，即如SEQ ID NO 1所示序列的第46位到第79位。
6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体是attB分别在载体pEGFP-attB-Nl 的Eco0109I位点、AseI位点和PciI位点中的一个或多个插入获得的。
7.一种利用噬菌体Φ031整合酶系统转基因方法，包括将含有attB序列的携带外源基因的载体和表达6C31整合酶的载体共转染宿主细胞，其特征在于，所述的含有attB序列的携带外源基因的载体中含有的两个或两个以上互相间隔的attB序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是真核细胞。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是人细胞、牛细胞或者羊细胞。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达ΦC31整合酶的载体与含有 attB序列的携带外源基因的载体的转染比例是1 1 1 50。
全文摘要
本发明公开了一种携带attB序列高效率定向整合基因组假attP位点的载体以及一种高效率定向整合基因组假attP位点的转基因方法。在携带外源功能基因的载体中插入多个互相间隔的attB序列，和表达噬菌体φC31整合酶的载体共转染宿主细胞，可以实现attB与基因组中的假attP位点的高效整合及外源基因的表达。载体携带3个attB和2个attB的整合率分别为携带1个attB载体的2.8和2.2倍。比不含整合酶的随机整合则分别提高了14.5和12倍多。有利于整合酶系统在基因治疗和转基因动物领域的应用。
文档编号C12N15/63GK102399810SQ20111031299
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者曾凡一, 曾溢滔, 谢飞 申请人:上海市儿童医院, 上海滔滔转基因工程股份有限公司