专利名称：含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及α -氨基酸酯水解酶，更具体地说是涉及黄单胞菌Xanthomonas菌株的 α -氨基酸酯水解酶(a-amino acid ester hydrolase, AEH)基因的全序列及其所编码的酶蛋白，目的基因aeh基因克隆在大肠杆菌中的稳定表达。
背景技术：
1972年，Takahashi等人在寻找能合成侧链有氨基的β -内酰胺抗生素的过程中，发现某些细菌能够通过α -氨基酸酯酰化7-aminocephem类母核合成非天然的头孢类抗生素。而负责该反应的酶由于底物范围限于带α-氨基的酰基供体，而且相对酰胺，该酶和酯的亲和性更高的原因被命名为α-氨基酸酯水解酶。α-氨基酸酯水解酶有诸多优点由于和酰胺的亲和力低，底物水解少；不受苯甘氨酸的抑制；对D型苯甘氨酸甲酯有构象选择性， 工业上可以直接使用消旋混合物，而不必先进行拆分；其最适反应pH比青霉素酰化酶低，也使反应体系中的底物和产物更稳定。长期以来，对α-氨基酸酯水解酶的研究受到生物学家和药学家的重视，有关α -氨基酸酯水解酶产酶菌株的分离、酶基因的鉴定及其在生物转化中的应用也有不少报道。Polderman-Tijmes等人通过定点突变确定了混池醋酸杆菌(Acetobacter turbidans') f11 α -氨基酸酯水解酶的活性中心氨基酸位点(J. BiologicalChemistry vol277, No32:28474, 2002)。Barends 等人描述了柑橘黄单胞菌citr I)中α -氨基酸酯水解酶的基因序列，及I. 9埃分辨率的酶晶体结构(J. BiologicalChemistry vol278, No25:23076，2003)。在使用菌株所产α -氨基酸酯水解酶合成头孢氨节、头孢丙烯、头孢曲嗪和头孢唑啉的过程中发现，在所制备无细胞裂解液中含有头孢菌素酶，而该酶对β-内酰胺环具有极强的水解活力。虽然可以通过进一步纯化细胞裂解液特异性地去除头孢菌素酶，但由于生产成本和产品质量，纯化不是理想的措施。
发明内容
本发明的目的是构建一个转化体的重组载体中导入的α-氨基酸酯水解酶基因片断可以使大肠杆菌表达宿主制备的无细胞裂解液没有原宿主黄单孢菌株对β—内酰胺环的明显的破坏作用，可应用于合成头孢类抗生素药物的含有α -氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌。缩写列表
7—ADCA -J-氨基去乙酰氧基头孢烷酸
PGM :D-苯甘氨酸甲酯
7一ACCA -J-氨基-3氯-头抱烧酸
7—ACA -J-氨基头孢烷酸
7—APRA -J-氨基-3-丙烯基头孢烷酸
7—TACA :7_氨基-3-(1,2,3-三唑-5-硫)甲基-头孢烷酸
本发明是这样实现的
本发明含有α—氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌，其特征在于是由大肠杆菌携带导入的含一氨基酸酯水解酶基因片断aeh作为目的基因的重组质粒pET28a — aeh构成，大肠杆菌的脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，导入的目的基因的氨基酸序列见序列表中序列2。制备方法如下 (1)提取黄单孢菌基因组，
(2)将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM_T，aeh的酶切位点为EcoRI和XholJf EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM_T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh,
(3 )将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pET28a_aeh，
(4)从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细
胞，
(5)培养转化细胞，使重组质粒pET28a— aeh随大肠杆菌BL21 (DE3)细胞一起大量扩
>曰，
(6 )从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21(DE3) /pET28a_aeh。步骤(2)中以黄单孢菌基因组为模板，一对寡核苷酸EcoRI5'和XhoI3'为引物，扩增得ECoRI5HhoI片段，经凝胶电泳分离纯化，得分别在5'端和:T端具有EcoRI5'和Xhor酶切位点的片断与载体pGEM-T连接。应用于7-ADCA或7-APRA或7-TACA或7-ACA衍生物的合成。7-ADCA、7-APRA、7-TACA、7-ACA的衍生物分别是头孢氨苄、头孢丙烯、头孢曲嗪和头孢唑啉。本发明中的大肠杆菌表达宿主所制备的无细胞裂解液对β-内酰胺环的破坏作用明显减少，可用于以7-ADCA为中间体合成头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢曲嗪、头孢唑啉。具有工业应用前景。原产生菌ZafliAofflmasrubriIineans 和本发明大肠杆菌 BL21(DE3)/pET28a_aeh应用于7-ADCA到头孢氨苄的转化过程中对β -内酰胺环的破坏程度的比较。本发明大肠杆菌由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间2011年4月11日，保藏编号CGMCC No. 4757。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名大肠埃希氏菌 Escherichia coli。将原产生菌和大肠杆菌 BL21 (DE3)/pET28a_aeh 分别应用于7-ADCA到头孢氨苄、7-APRA到头孢丙烯、7-TACA到头孢曲嗪的转化，比较它们对β-内酰胺环的破坏程度。表I 原产生菌 Xan thomonas rubriIineans 和本发明大肠杆菌 BL21 (DE3 ) /pET28a-aeh应用于7-ADCA到头孢氨苄的转化过程中对β -内酰胺环的破坏程度表的数据可以看出大肠杆菌宿主对内酰胺环的破坏程度大大降低，可应用于大规模的生产之中。
权利要求
1.含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌，其特征在于是由大肠杆菌携带的含α -氨基酸酯水解酶基因aeh的重组质粒pET28a_aeh构成，大肠杆菌的脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，导入的目的基因的氨基酸序列见序列表中序列2，该大肠杆菌拉丁文名.^Escherichia co7i,保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No. 4757。
2.根据权利要求I所述的大肠杆菌，其特征在于制备方法如下 (1)提取黄单孢菌基因组， (2)将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM_T，aeh的酶切位点为EcoRI和Xhol，将EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM_T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh, (3 )将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pET28a_aeh， (4)从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞， (5)培养转化细胞，使重组质粒pET28a— aeh随大肠杆菌BL21 (DE3)细胞一起大量扩>曰， (6 )从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21(DE3) /pET28a_aeh。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于步骤(2)中以黄单孢菌基因组为模板，一对寡核苷酸EcoRI5'和XhoI3'为引物，扩增得EcoRI5HhoI片段，经凝胶电泳分离纯化，得分别在5'端和:T端具有EcoRI5'和XhoI3'酶切位点的片断与载体pGEM_T连接。
4.根据权利要求I所述的大肠杆菌的应用，其特征在于应用于7-ADCA或7-APRA或7-TACA或7-ACA衍生物的合成。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌的应用，其特征在于7-ADCA、7-APRA、7-TACA、7-ACA的衍生物分别是头孢氨苄、头孢丙烯、头孢曲嗪和头孢唑啉。
全文摘要
本发明为含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌，解决原有宿主菌黄单胞菌Xanthomonasrubrilineans的β-内酰胺酶对β-内酰胺环的水解作用。测定了来源于Xanthomonasrubrilineans菌株的a-氨基酸酯水解酶基因全序列及其所编码的酶蛋白，确定目的基因aeh，并提供含有该基因的重组质粒pET28a及构建的E.coliBL21(DE3)宿主菌，该宿主菌拉丁文名Escherichiacoli，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCCNo.4757。目的基因氨基酸序列见序列表中序列2，目的基因核酸碱基序列见序列表中序列1。该宿主菌克服了原有宿主菌的β-内酰胺酶对诸多头孢类抗生素母核，如7-ADCA等及其衍生物有破坏性的缺点。该宿主菌可一般地应用于合成头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢曲嗪、头孢唑啉。
文档编号C12N15/70GK102653726SQ20111035569
公开日2012年9月5日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者叶丽娟, 李端华, 潘佳林, 王辂, 褚以文, 赵晨 申请人:中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所