专利名称：黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物。
背景技术：
斑皮蠹属害虫是重要的仓储害虫。目前对斑皮蠹的鉴定，主要根据形态学特征进行判别。但由于斑皮蠹类成虫个体一般都比较小，且种间的形态差异不明显，经常造成鉴定中的种间混淆。皮蠹个体小，成虫体长2. 0-3. 5mm，且形态酷似不易区分。对成虫的鉴定，主要根据触角棒节数、触角窝深浅、鞘翅颜色及斑纹特点等来鉴别；幼虫体长4. 0-6. Omm, 一般是根据着生的刚毛数量和类型、第8腹节背板前脊沟是否完整和上内唇感觉乳突的个数等来鉴别。皮蠹的形态鉴别需要解剖后在显微镜下观察，例如两者幼虫最重要的鉴别特征为触角和上内唇，只有0. 1-0. 2mm大小，而其上的特征，如刚毛和乳突就更加细小，因此稍有不慎就可能将其破坏或丢失。这就不但需要鉴定工作者有丰富的技术经验并且还得保证皮蠹害虫的完整性，从而使得皮蠹近缘种害虫的形态鉴定成为了日益费时费事的难题。COI基因是动物线粒体DNA中非常保守的编码蛋白基因，它具有相对的保守性同时又有足够的变异，即使是亲缘关系很近的类群也存在几个百分比的差异，所以COI常被用来反映种群遗传变异信息，分析亲缘关系较近的种、种下分类单元等。COI的序列差异性分析在双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、缨翅目等昆虫的鉴别中都被用来作为重要的鉴别依据。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比对更容易操作。目前，COI序列差异性分析已经成为物种间分类最普遍的分子标记之一。分子生物学技术手段已被用于昆虫的鉴定分类中，目前对皮蠹属近缘种的鉴定， 主要采用传统的形态分类学，尽管也有采用PCR扩增片段，通过测序来鉴定的方法，但耗时且费用高，还没有相关的快速分子生物学检测方法。因此如何能够快速准确的对斑皮蠹进行鉴定，已成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测皮蠹的引物对。本发明提供的引物对，由引物1和引物2组成；上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。上述引物对中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本发明的另一个目的是提供一种检测皮蠹的试剂。本发明提供的试剂，由上述引物对和AflII组成。在上述试剂中，所述引物对和所述AflII为独立包装；在上述试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本发明的第三个目的是提供一种检测皮蠹的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由上述的引物对、dNTP、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；在上述PCR试剂中，所述引物对中的各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5μΜ。在上述PCR试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本发明的第四个目的是提供一种检测皮蠹的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的试剂或上述的PCR试剂；在上述试剂盒中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测皮蠹中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述皮蠹具体为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测皮蠹的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)用上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒中的引物对对待测皮蠹进行PCR扩增，得到扩增产物；2)分别用AflII酶切步骤1)得到的扩增产物，得到酶切产物，若所述酶切产物为535bp和347bp大小，则待测皮蠹为或候选为黑斑皮蠹；若所述酶切产物仍为880bp大小，则待测皮蠹为或候选为花斑皮蠹。在上述方法的PCR扩增中，以待测皮蠹的基因组DNA为模板；在上述方法的PCR扩增中，退火温度为50°C-55°C，在本发明的实施例中采用的退火温度为55°C。在上述方法中，检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的实验证明，本发明根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。本发明的优点在于1、缩短检测所需时间，从收集样品到检测完毕仅需1天。2、所需样品量大大减少，同时检测精准度大大提高。甚至虫体不完全时也可以进行检测鉴定，且结果可信度高。3、成本大大降低。此外，本方法还弥补了传统分类鉴定中需要提供完整虫体的要求，因为在实际检疫工作中，斑皮蠹属害虫在生活过程中不断在粮粒或其他储藏物内穿行，身上的毛极易脱落，尤其幼虫体表组织柔软，使得有些虫体不能保持完整，而本实验方法即使在虫体不完全时也可以进行检测鉴定。
图1为皮蠹的PCR扩增结果图2为限制酶AflII酶切皮蠹PCR产物的电泳图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、引物的设计根据已有的谷斑皮蠹的序列(基因序列号FJ58973)，设计引物Tgla-F 5-CAACATTTATTTTGATTT-3 (序列 1)Tgla-R 5-TCCAATGCACTAATCTGCCA-3 (序列 2)实施例2、黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定1、皮蠹样品DNA的提取分别取编号为1和2的两头皮蠹分别由黄埔出入境检验检疫局(采集于广州黄埔)和山东农业大学提供(采集于山东泰安)，采用Tiangen组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)，按照说明提取被测样品总DNA。具体为将活虫在200 μ 1 GA缓冲液中研磨碎，混勻后加入20ul蛋白酶K，37°C放置4hr。随后加入200 μ 1 GB缓冲液，混勻后，在70°C放置lOmin。加入200ul无水乙醇，充分混勻15s。将所得溶液转入CB3 吸附柱中，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入 0. 5ml⑶缓冲液，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3 中加入0. 7ml漂洗液PW，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入0. 5ml漂洗液PW，离心，12，OOOrpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。 离心，12，OOOrpm，2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温几分钟，以彻底晾干残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中央滴加50ul洗脱缓冲液TE，室温放置 5min, 12，OOOrpm离心2min,分别得到1和2的总DNA。2、PCR 扩增分别以上述1得到的1和2的总DNA为模板，以Tgla-F和Tgla-R为正反向引物，加入PCR试剂盒提供试剂(Tiangen)，进行片断扩增，反应体系为20ul，其中2 μ 1 IOXTaqReaction Buffer 缓冲液，1. 25U Taq polymerase, 1 μ 1 dNTP (终浓度 125 μ Μ)， 0. 5μΜ/弓丨物(终浓度0· 5μΜ/引物)，20ng DNA。反应条件为95°C，5min，1个循环；94°C, 30s，55°C，45s，72°C，lmin，35 个循环；最后 72°C延伸 10min，l 个循环。扩增后产物在2%琼脂糖胶中进行电泳，结果如图1所示，可以看出，其中1为1 号皮蠹PCR产物，2为2号皮蠹PCR产物，3. 200bp DNAladder (Tiangen)从上到下依次为 第一条带4000bp ；其它从2200bp开始，每条递减200bp，直至最低条带200bp ；可以看出， 均得到大小约为880bp的PCR产物。2、酶切及结果检测将上述1号皮蠹PCR产物和2号皮蠹PCR产物分别采用特异性酶AflII进行酶切，酶切体系20yL反应体系如下10U Afl ΙΙ,2μ L 10 X NEBuffer, 0. 2 μ LlOO X BSA, DNA 的 PCR 产物 17. 3 μ L (终浓度约 370ng/ul)。将混合体系在 PCR 仪 37°C 条件下孵育ι小时后，各取 ο μ L酶切产物，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并拍照。酶切后产物在2%琼脂糖胶中进行电泳，电泳后EB染色，以检测酶切结果，具体为取lOulDNA扩增产物，与样品缓冲液混合均勻，点入2%琼脂糖胶中，进行电泳，90V， 35min。电泳后EB染色lOmin，在UV灯下检测结果。若得到的PCR产物经过AflII酶切后得到535bp和347bp的片段，则待测样品为
黑斑皮蠹；
若得到的PCR产物经过AflII酶切后仍为880bp左右的片段，则待测样品为花斑皮蠹。结果如图2所示，其中1. IOObpDNAladder(Tiangen)，从上到下依次为第一条带1500bp ；其它从IOOObp开始，每条递减lOObp，直至最低条带100bp，2. 1号皮蠹PCR产物酶切后，3. 2号皮蠹PCR产物酶切后，4. 200bp DNAladder(Tiangen)从上到下依次为第一条带4000bp ；其它从2200bp开始，每条递减200bp，直至最低条带200bp。可以看出，1 号皮蠹PCR产物酶切后得到535bp和347bp的产物，2号皮蠹PCR产物酶切后，仍为880bp 左右的片段，说明1号皮蠹为黑斑皮蠹，2号皮蠹为花斑皮蠹。将上述1号皮蠹PCR产物和2号皮蠹PCR产物分别送去测序，结果分别为序列表中的序列4和序列表中的序列3，与genbank比对，序列4即为黑斑皮蠹的COI部分序列，而序列3即为花斑皮蠹的COI部分序列，这个检测结果与本发明的检测结果一致，证明本发明的方法正确。
权利要求
1.一种检测皮蠹的引物对，由引物1和引物2组成所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于 所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
3.—种检测皮蠹的试剂，由权利要求1或2所述的引物对和AflII组成。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于 所述引物对和所述AflII为独立包装；所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
5.一种检测皮蠹的PCR试剂，由权利要求1或2所述的引物对、dNTP、DNA聚合酶及PCR 缓冲液组成；所述引物对中的各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5μΜ ；所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
6.一种检测皮蠹的试剂盒，包括权利要求3或4所述的试剂或权利要求5所述的PCR 试剂；所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
7.权利要求1或2所述引物对或权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒在检测或辅助检测皮蠹中的应用；所述皮蠹具体为黑斑皮蠹和 /或花斑皮蠹。
8.—种检测或辅助检测皮蠹的方法，包括如下步骤1)用权利要求1或2所述引物对或权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒中的引物对对待测皮蠹进行PCR扩增，得到扩增产物；2)分别用AflII酶切步骤1)得到的扩增产物，得到酶切产物，若所述酶切产物为535bp和347bp大小，则待测皮蠹为或候选为黑斑皮蠹； 若所述酶切产物仅为880bp大小，则待测皮蠹为或候选为花斑皮蠹。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述PCR扩增中，以待测皮蠹的基因组DNA为模板； 所述PCR扩增的退火温度为50°C -55°C。
10.根据权利要求8或9的方法，其特征在于所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物。本发明提供的引物对，由引物组1和引物2组成；上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。本发明的实验证明，本发明根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。
文档编号C12Q1/68GK102399878SQ20111036189
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者刘二龙, 刘聪, 吕英姿, 林惠娇, 樊武疆, 王新国, 班丽萍, 蒋湘 申请人:中国农业大学