专利名称：荧光pcr毛细管电泳检测flt3-itd基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications, ITD)突变的试剂盒,特别是涉及以突光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-1TD的试剂盒。由于本试剂盒对全血或骨髓样品中的FLT3-1TD的检测和分析具有很高的灵敏度和特异性，可广泛应用于白血病判断预后，指导治疗和预测疾病复发等多个领域。
背景技术：
FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3)是III型受体酪氨酸激酶家族中的一员，其突变与白血病的发生密切相关。FLT3与其配体(FL)在造血干/祖细胞的增殖和分化中起重要的调节作用。FL与FLT3的细胞外结构域结合介导一系列细胞内信号传导途径，调节细胞增殖和活化。当FLT3发生基因突变时，可导致FLT3非配体依赖性磷酸化，破坏正常血细胞的增殖、分化与凋亡。FLT3突变有两种形式:一种为发生在FLT3基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications, ITD),称为 FLT3-1TD 突变,ITD 的大小和位置都存在多态性，典型的ITD位于第14外显子，也可累及第14内含子和第15外显子；一种为发生在酪氨酸激酶结构区域的点突变，称为FLT3-TKD突变。目前有关于FLT3-1TD突变的研究表明FLT3-1TD突变最常出现在急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中，突变发生率为15% 35%，其次为骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)，突变发生率约为2% 5%。FLT3-1TD在急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中发生率极低(低于1% )，而在慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、成人体细胞白血病中尚未发现FLT3-1TD突变。AML是一组起源 于造血干细胞的恶性血液病，具有高度异质性。在影响AML预后危险度的众多因素中，细胞遗传学已被认为是最重要的独立预后因素，一些特异性染色体核型异常，不仅成为AML诊断中的重要标志物，并常被认为是判断预后的标志。但是大约40 % 50 %的AML患者未检测到染色体核型异常，这些患者预后变异较大，5年生存率24% 42%。所以寻找核型正常AML患者的预后分子标志成为人们关注的焦点。随着分子遗传学检测方法的应用，学者们发现正常核型的AML患者在分子学水平上是存在异质性的，包括基因突变或某些特定基因的表达异常，为AML患者的进一步预后分级及分子靶向治疗提供了依据FLT3基因突变是已发现的影响AML患者预后的分子标志之一，可作为AML患者预后不良的独立指标。FLT3-1TD突变是AML患者中最常见的一种突变类型，约15% 35% AML病例存在FLT3-1TD突变，另外还有约7%的AML病例存在FLT3-TKD突变。但是目前大部分研究认为FLT3-TKD突变与AML预后无关，而FLT3-1TD突变与AML发病和发展密切相关，是一个重要的独立预后因素。FLT3-1TD阳性患者具有较独特的临床特征，目前针对于此突变的靶向治疗也已经进入不同的临床试验阶段。而且，不同ITD患者的预后也存在差别，这与ITD-AR(internal tandem allelic ratio,内部串联重复等位基因比例)值有关，即ITD:WT (FLT3野生型基因)比值，ITD-AR值增加可能导致预后不良，因此ITD-AR值也是AML患者的很强的独立预后因素。MDS患者FLT3-1TD突变相比于没有突变的患者，FLT3-1TD阳性患者转为AML的概率有增高趋势，进展为AML的时间有缩短趋势，且总体生存期缩短，MDS转为AML后，FLT3-1TD阳性率增高，因此FLT3-1TD是MDS转化为AML的高危因素，为预后不良因素。综上，FLT3-1TD可作为AML和MDS患者预后不良的独立指标，对FLT3-1TD基因突变进行检测可以帮助判断预后，用于指导治疗、判断疗效和疾病复发，对增加患者的长期生存率和生存质量有着非常重要的意义。FLT3-1TD基因突变检测试剂盒(荧光PCR毛细管电泳法)提供一种快速检测FLT3-1TD基因突变的方法。本方法根据PCR引物设计原理，分别在FLT3-1TD发生的14外显子和15外显子的两端设计上下游引物，对于发生FLT3-1TD基因突变的DNA标本，将会出现大于正常片段的扩增产物。本方法通过毛细管电泳方法检测PCR产物的长度来确定是否存在FLT3-1TD基因突变，并可以通过软件分析计算ITD-AR值，以期为AML和MDS的临床诊断、预后判断及分子靶向治疗提供理论依据。相比普通的琼脂糖凝胶电泳，该方法更加灵敏，且能准确判断突变条带的片段大小及基因剂量。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用荧光PCR毛细管电泳技术检测白血病临床样品中FLT3-1TD基因突变的试剂盒。该试剂盒通过提取患者血液或骨髓的DNA，使用PCR方法扩增FLT3的ITD区域，然后使用荧光PCR毛细管电泳技术对ITD片段大小及剂量进行检测。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案:(I)使用适当的核酸分析软件对已知的FLT3基因核苷酸序列进行同源性比较并找出同源区段的基础上 ，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer 3)选择并设计寡核苷酸引物。由于所设计的引物在FLT3-1TD发生的14外显子和15外显子的两端，而且与其他基因表达mRNA的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以避免了 FLT3-1TD检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度；(2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的引物序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite0以FPLC层析法纯化荧光标记的引物。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20% )电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针；(3)从得自受试者的外周血或者骨髓中提取DNA，然后使用PCR反应体系将其扩增；(4)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(C) 2_脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的扩增反应体系，以及包括(d)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(e)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物。通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；通过荧光PCR毛细管电泳技术以检测靶多核苷酸的片段长度。本发明所提供的荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-1TD的试剂盒包括=(I)PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和⑵分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液包括5’端结合有荧光发生基团的正向引物、反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，特征在于所使用的引物序列分别为:5’ -FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA -3，(SEQ ID NO:1)、5' -ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3' (SEQ ID NO:2)，其中 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 匹配在一起可以检测FLT3-1TD。本发明的另一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为:5’ -FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3’(SEQ ID NO:3)、5' -TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3' (SEQ ID NO:4)，其中 SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4 匹配在一起可以检测FLT3-1TD。本发明的另一 个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为:5’-FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’ (SEQ ID NO:5)，5’-TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’ (SEQID NO:6)，其中 SEQ ID NO::5，SEQ ID NO:6 匹配在一起可以检测 FLT3-1TD。本发明的另一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为:5’-FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3’ (SEQ ID NO:7)，5’-AGCATTTTGACGGCAACC-3’ (SEQ IDNO:8)，其中 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 匹配在一起可以检测 FLT3-1TD。本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液，特征在于每25微升的PCR缓冲液中加入 2 单位 Taq 酶，缓冲液包含 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、150mM KCl、3mM MgCl20本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应体系由PCR缓冲液、耐热DNA聚合酶、dNTPs，引物所组成，其特征在于引物的序列组合为SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ IDNO:8。本发明的一个优选实施方案，其中阴性质控品为去离子水，阳性质控品为携带有FLT3-1TD序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO:1和SEQ ID N0::2，或SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO::4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。本发明的一个优选实施方案，根据复合扩增产物片段大小来分析样本中FLT3正常基因和FLT3-1TD和剂量变化，任何可以分离核酸片段大小的方法例如过滤，高效液相色谱，电泳，亲和收集等方法均可用于本发明，其中通过凝胶电泳的方法进行分离并定量，优选使用毛细管电泳法分离FLT3正常基因和FLT3-1TD。本发明的一个优选实施方案，可以根据引物扩增产物的累计荧光值定量FLT3正常基因和FLT3-1TD的相对量，并通过计算FLT3正常基因和FLT3-1TD相对剂量来分析ITD-AR 值。本发明的一个优选 实施方案，其中试剂盒的待检样品可选自但不局限于白血病患者的临床样品。本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的靶多核苷酸来自FLT3基因。本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。特别值得说明的是，为了确保本发明的FLT3-1TD检测方法的准确性，我们还使用携带有FLT3-1TD序列的重组质粒作为阳性质控品。借助这些阳性质控品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测，以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。本技术与现有技术相比，优点为:①反应灵敏高，DNA浓度为IOng/μ I时即可检出②结合毛细管电泳能对基因进行精确定量③能对突变型基因与野生型基因比例进行分析统计④在大量野生型基因存在下，亦能检测出低频突变型基因。
图1显示一个正常男性样本多重扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp的蓝色条带为一个正常男性样本的扩增产物。图2显示一个正常女性样本多重扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp的蓝色条带为一个正常女性样本的扩增产物。图3显示一个男性AML患者的FLT3-1TD样本扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp和360bp的两条蓝色条带，显示一个男性AML患者的FLT3-1TD样本扩增产物。图4显示一个女性AML患者的FLT3-1TD样本扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp和360bp的两条蓝色条带，显示一个女性AML患者的FLT3-1TD样本扩增产物。图5显示一个MDS患者样本的FLT3-1TD的扩增产物的电泳图。图中片段大小约为330bp和360bp的两条蓝色条带，显示一个MDS患者样本的FLT3-1TD的扩增产物的电泳图。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1:检测试剂盒及其使用1、制备包括下列组成成分的试剂盒:ITD PCR反应液A(内含SEQ ID NO:1和SEQID NO::2) (500 μ I/ 管)、ITD PCR 反应液 B (75 μ I/ 管)、ITD 阳性质控品(50 μ I/ 管)、阴性质控品(δΟμΙ/管)。2、标本米集、运送和保存:(I)标本采集:标本为外周血或骨髓。抽取受检者静脉血或骨髓3_5ml，注入含EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5 10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。(2)保存:可立即检测，4°C保存一周，_20°C保存期可达一年。(3)运输:标本运送应采用0°C冰壶。3、检测步骤和结果分析:DNA提取建议使用Qiagen DNA提取试剂盒。(I)取200 μ I外周血或骨髓至1.5ml离心管。(2)加入20 μ I的蛋白酶。(3)加入 200 μ I 的 Buffer AL，振荡 15 秒。(4)56°C温育 10 分钟。(5)加入200 μ I乙醇,振荡15秒。
(6)将混合液吸入 QIAamp Mini spin column,6000g 离心 I 分钟。(7)将内柱放入一个新的套管中，加入500 μ I的Buffer AWl，6000g离心I分钟。(8)将内柱放入一个新的套管中，加入500 μ I的Buffer AW2，6000g离心I分钟。(9)将内柱放入一个新的1.5ml离心管中，最大离心速度离心I分钟。(10)加入200 μ I的Buffer AE，室温静置I分钟，6000g离心I分钟。(11)得到 200 μ I DNA 溶液QF-PCR 操作步骤:1、对于每一个PCR反应体系，混合以下成分到总体积为25ul。设置阴阳性对照。
权利要求
1.一种检测样品中FLT3-1TD的试剂盒，试剂盒包括:(I) PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括5 ’端结合有荧光发生基团的正向引物、反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量，其特征在于所使用的正反向引物的序列可以为:5，-FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA-3\5/ -ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3'；5，-FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3\5/ -TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3'；5’ -FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’、5’ -TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’ ；5’ -FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3'5’ -AGCATTTTGACGGCAACC-3’。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR缓冲液包含IOmMTris-HCl (pH8.0)、150mM KCl、3mM MgCl2，每25微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应体系由PCR缓冲液、耐热DNA聚合酶、dNTPs，引物所组成，其特征在于引物的序列组合为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4，或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQID NO:8。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阳性质控品为携带有FLT3-1TD序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4，或SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6，或 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测样品为全血或骨髓等白血病临床样品O
全文摘要
本发明涉及检测FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications，ITD)突变的试剂盒，特别是涉及以荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-ITD的试剂盒。本试剂盒主要包括PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒、以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。本试剂盒对全血或骨髓样品中的FLT3-ITD的检测和分析具有很高的灵敏度和特异性，可广泛应用于白血病判断预后，指导治疗和预测疾病复发等多个领域。
文档编号C12Q1/68GK103103251SQ20111036170
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者李明, 陈嘉昌, 陈华云, 高云, 程钢, 何蕴韶 申请人:中山大学达安基因股份有限公司