专利名称：一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法
技术领域：
本发明涉及花生分子育种领域，具体涉及一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法。
背景技术：
花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和品质。随着生物技术的发展，利用转基因技术来改进花生栽培种受到研究者的广泛重视。而在花生遗传转化过程中利用抗生素类基因和抗除草剂类基因进行筛选，有可能会对环境及人类健康产生不良影响和损害。因此，利用无争议的生物安全标记基因来构建表达载体，便逐渐成为新的研究热点。木糖是半纤维素的主要组成部分，自然界中存在着某些利用木糖的丝状真菌、酵母菌和细菌，但是许多植物细胞不能利用木糖，所以难以将木糖基因等安全标记基因用于植物中以筛选转化体。
发明内容
针对现有技术中花生遗传转化过程中利用抗生素类基因和抗除草剂类基因进行筛选存在的缺陷和不足，本发明提供了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法。本发明构建了含有xylA基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA，并通过农杆菌介导法转化花生胚小叶外植体，在添加了蔗糖(5g/L)和木糖(10g/L)的培养基上进行筛选，诱导成苗率达15. 25%，转基因阳性率达到77. 27%。本发明避免了利用抗生素筛选可能造成的安全隐患，而且转化效率高，是一种安全、高效的筛选方法。为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现 一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，它包括以下步骤
(1)将目的基因插入到含木糖异构酶基因xylA的植物表达载体中，构建含有目的基因的重组载体；
(2)将重组载体转化花生胚小叶外植体；
(3)将转化后胚小叶外植体转移到添加有蔗糖和木糖的诱导培养基上进行培养，4飞周后诱导出体胚；
(4)将体胚转移到添加有蔗糖和木糖的萌发培养基上进行培养，Γ5个月后诱导成
苗；
(5)对再生苗进行PCR检测，获得转基因阳性植株；
(6)将转基因阳性植株通过嫁接方法移栽田间。对技术方案的进一步改进所述步骤(1)中植物表达载体为pCAMBIA1301-xylA。对技术方案的进一步改进所述步骤O)中利用农杆菌介导法将重组载体转化花生胚小叶外植体。对技术方案的进一步改进所述步骤(3)中诱导培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、10mg/L 2，4-D的MS-B5培养基。对技术方案的进一步改进所述步骤中萌发培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L 木糖、％ig/L BAP的MS-B5培养基。对技术方案的进一步改进所述步骤C3)和(4)中的培养条件为25°C、30001x、每日光照1池。对技术方案的进一步改进所述步骤(5)中PCR检测的xylA基因引物为 上游引物为 5 ‘ -CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3 ‘，
下游引物为 5 ‘ -CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3 ‘。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是
1、本发明所述将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，使用添加了蔗糖(5g/ L)和木糖(10g/L)的培养基进行培养，转化体在木糖异构酶基因xylA的催化下能将木糖转化为木酮糖，再经过磷酸戊糖途径分解代谢，为细胞生长所利用，在以木糖为主要碳源的培养基上，转化细胞因能利用木糖而呈现优势生长，非转化体则因碳源供应不足而使生长受到抑制不能成苗。因此可以筛选出转化体，避免了使用抗生素进行筛选可能造成的安全隐
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)Qi、O2、在添加蔗糖(5g/L)和木糖(10g/L)的培养基进行培养，诱导成苗率达15. 25%， 所得到的再生植株经PCR检测阳性率高达77. 27%，是一种安全、高效的筛选方法。
图1是本发明中花生胚小叶外植体在添加蔗糖(10g/L)的培养基上的生长情况。图2是本发明中花生胚小叶外植体在添加蔗糖(5g/L)的培养基上的生长情况。图3是本发明中转基因植株在添加蔗糖(5g/L)和木糖(10g/L)的培养基上筛选后的PCR检测结果。图4是本发明中转基因再生植株嫁接移栽田间生长情况。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细说明。实施例1、建立将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法 l、xylA基因的克隆
根据GenBank中xylA基因序列(登录号No. X04691)设计引物，并在引物5 ‘末端添加 Xho I酶切位点(斜体部分)
上游引物为 5 ‘ -C7TG^ATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3 ‘， 下游引物为 5 ‘ -C7TG^ATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3 ‘。以大肠杆菌DH-5 α菌株基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增xylA基因并将其克隆到pMDIS-T载体(购自宝生物大连工程有限公司)上，得到T-xylA重组质粒。2、植物表达载体pCAMBIA1301_xylA的构建
用损ο I酶切PCAMBIA1301质粒(购自上海希匹吉生物技术有限公司)，去掉潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin-B-phosphotransferase, Hpt), M Xho I 酶切 T-xylA 重组质粒，切下xylA基因片段。回收pCAMBIA1301质粒大片段和xylA基因小片段，用 T4 DNA连接酶将xylA片段连接到切除Hpt基因的pCAMBIA1301质粒上，得到重组质粒 pCAMBIA1301-xylA。3、将表达载体转化花生，包括以下步骤
a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备将pCAMBIA1301-xylA重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105 (购自北京天恩泽基因科技有限公司)感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB (利福平50mg/L，卡那霉素 50mg/L)液体培养基中，280C、180rpm培养至OD6tltl=O. 5 0. 8时，取2mL菌液转移到50mL YEB (利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培养基中，培养到OD6tltl=O. 6、. 8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体MS-B5悬浮备用。b、花生胚小叶外植体的分离将连同胚轴的花生胚小叶切下，在70%乙醇中浸泡 l(T20s，0. 1%升汞中浸泡8min，无菌水冲洗后浸泡过夜，次日将胚轴切去分离出胚小叶， 放入MS-民培养基中预培养3天，培养条件为25°C、30001x、每日光照13h。C、农杆菌介导的遗传转化将预培养3天后的胚小叶外植体浸于已备好的农杆菌菌液中J8°C、90rpm温和震荡侵染15min。用无菌滤纸将残留菌液吸干，接种到MSi5培养基中共培养3天后，转移到添加羧苄青霉素(500mg/L)的体胚诱导培养基(MS-B5，添加 10mg/L 2，4-D)中培养，约4 5周后诱导出体胚。培养条件为25°C、30001x、每日光照13h。4、木糖筛选体系的建立，包括以下步骤
a、基本培养基和培养条件培养基为MS-B5,添加不同浓度的蔗糖/木糖浓度比、0. 8% 琼脂，？11为5.8，在121°C、105Kpa条件下灭菌20min。培养条件为25°C、30001x、每日光照 13h。b、最适蔗糖浓度的确定取花生品种“花育22”成熟种子M粒，分为4组，每组6 粒。分离胚小叶外植体(方法同上)，0. 1%升汞消毒lOmin，然后转移到MS^5培养基进行培养，蔗糖浓度分别为5g/L，10g/L，20g/L，30g/L。培养4 5个月后进行统计分析。结果表明当蔗糖浓度在10g/L及以上浓度时，外植体可以分化成苗(如图1所示)；当蔗糖浓度为5g/ L时，外植体停留在体胚阶段，不能分化成苗(如图2所示)。所以最终确定5g/L为蔗糖最低临界浓度。C、最适木糖浓度的确定利用农杆菌介导法将重组质粒pCAMBIA1301-xylA转化花生胚小叶外植体，然后转移到添加了蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5 g/L, 10 g/L，20 g/ L,30g/L)的体胚诱导培养基上进行培养。诱导出的体胚转到添加了蔗糖(5g/L)和不同浓度木糖(5 g/L, 10 g/L, 20 g/L，30g/L)的体胚萌发培养基上进行培养，约4飞个月诱导成苗后进行统计分析。结果如表1所示，随着木糖浓度的升高，诱导成苗率有所下降；当木糖浓度为5g/L时，诱导成苗率最高(17. M%)，但植株生长较弱；当木糖浓度为10g/L时，诱导成苗率较高(15. 25%)，植株生长健壮，且嫁接成活率高；所以最终确定10g/L为最适木糖浓度。表1 不同木糖浓度下外植体的成苗率及再生苗生长情况
权利要求
1.一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于它包括以下步骤(1)将目的基因插入到含木糖异构酶基因XylA的植物表达载体中，构建含有目的基因的重组载体；(2)将重组载体转化花生胚小叶外植体；(3)将转化后胚小叶外植体转移到添加有蔗糖和木糖的诱导培养基上进行培养，4飞周后诱导出体胚；(4)将体胚转移到添加有蔗糖和木糖的萌发培养基上进行培养，Γ5个月后诱导成苗；(5)对再生苗进行PCR检测，获得转基因阳性植株；(6)将转基因阳性植株通过嫁接方法移栽田间。
2.根据权利要求1所述的一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于所述步骤(1)中植物表达载体为pCAMBIA1301-xylA。
3.根据权利要求1所述的一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于所述步骤O)中利用农杆菌介导法将重组载体转化花生胚小叶外植体。
4.根据权利要求1所述的一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于所述步骤C3)中诱导培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、10mg/L 2，4_D的MS-B5 培养基。
5.根据权利要求1所述的一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于所述步骤(4)中萌发培养基是含有5g/L蔗糖、10g/L木糖、％ig/L BAP的MS-民培养基。
6.根据权利要求4或5所述的一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法， 其特征在于所述步骤(3)和中的培养条件为25°C、30001x、每日光照13h。
7.根据权利要求1所述的一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，其特征在于所述步骤(5)中PCR检测的xylA基因引物为上游引物为 5 ‘ -CTCGAGATGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3 ‘， 下游引物为 5 ‘ -CTCGAGATTATTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3 ‘。
全文摘要
本发明提供了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，它包括构建含有目的基因的重组载体；将重组载体转化花生胚小叶外植体；将转化后胚小叶外植体转移到添加有蔗糖和木糖的诱导培养基上进行培养，直至诱导出体胚；将体胚转移到萌发培养基上进行培养，直至诱导成苗；对再生苗进行PCR检测，获得转基因阳性植株；将转基因阳性植株通过嫁接方法移栽田间。本发明使用添加了5g/L的蔗糖和10g/L的木糖的培养基进行培养，非转化体由于不能利用木糖生长受到抑制不能成苗，转化体由于能够利用木糖可以再生成苗，因此可以筛选出转基因植株，避免了使用抗生素进行筛选可能造成的安全隐患；转化效率高，是一种安全、高效的筛选方法。
文档编号C12N15/82GK102433354SQ201110361128
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者丁霄, 乔利仙, 刘文平, 王晶珊, 隋炯明 申请人:青岛农业大学