专利名称：：臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法
技术领域：
：本发明涉及一种臭氧处理与罗伦隐球酵母处理结合对草莓采后病害防治的方法，属于水果采后生物防治领域。
背景技术：
：水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，也是全球关注的问题。据报道，在发达国家有10%-30%的新鲜产品由于采后病害导致腐烂，而在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，果实采后腐烂率则高达40%—50%。国外水果贮藏保鲜量占水果总产量60%以上，目前我国果品贮藏量800多万吨，不到总量的15%，其中冷藏库和气调库的贮藏量为70万吨，仅占总产量的7%。我国水果采后损失一般在20%-30%，高者甚至达到50%。2007年3月国家统计局发布的《中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示，2006年我国水果总产量达17050万吨。据此估算，我国水果采后的损失每年将达到数百亿元人民币的水平。水果腐烂的主要原因在于病原微生物的致病作用，这些病原微生物主要有灰葡11iBotrytiscinerea)>^1{Rhizopusstoloniger)>iPenicilliumspp.)、毛霉iMucorspp.)、链格孢(Alternariaspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)和软腐细菌(.Erwinia)等。病原微生物对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如扩展青霉0°.权/？浙仰)产生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢仪ci/^rea)产生的葡双醛霉素(botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温贮藏和化学杀菌剂处理。近年来低温贮藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果的需要。同时，在低温条件下仍有相当数量的致病菌能够在水果上生长，并造成水果腐烂。例如，能引起多种水果灰霉病的灰葡萄孢、BotiyriScinerea)，也称灰霉菌，在_0.5°C时也能生长繁殖，引起许多水果腐烂变质，造成严重经济损失。而那些对低温敏感的水果，因只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏，病原物的生长、繁殖更不能得到有效地抑制，腐烂相当严重。长期以来，控制水果采后病害的主要措施是使用杀菌剂。化学杀菌剂对防治病害可以起到立竿见影的效果，但是，化学杀菌剂长期和大量的使用，不仅导致病原微生物产生抗药性，同时严重污染环境，有损于人类健康。美国国家科学院(NationalAcademyofScinces)的一份报告显示，在用于处理食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致癌危险。随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的日益增强，目前多种化学杀菌剂(如CaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用，其直接的后果是目前许多水果采后病害已经没有杀菌剂能予以控制。因此，各国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成果，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。国外方面，Sansone等从苹果表面分离得到的粘红酵母对由召OiiTiisCinerea引起的灰霉病有显著的防治效果，在实验室条件下，其腐烂率与对照相比降低了M%。Calvente等的研究也发现粘红酵母对水果采后青霉病害有显著的抑制效果。我国水果采后病害生物防治研究起步较晚，郑晓冬等在体外和体内抑菌试验中研究了粘红酵母对由指状青霉引起的柑桔青霉腐烂的抑制效果，发现粘红酵母在控制由指状青霉引起的柑桔腐烂中显示出了很高的抑菌活性，在25°C条件下，对照的发病率为10096，而使用IXIO8个/ml的菌悬液的发病率仅为4596，而且随着酵母浓度的提高，发病率也有逐渐下降的趋势。张红印等研究了粘红酵母对草莓采后灰霉病的抑制效果，对草莓进行了前期的预处理后，接种IXIO9个/ml的菌悬液和IXlO5个/ml的病原菌孢子菌悬液分别在4°C下贮藏7天和20°C下贮藏2天后，发现接种粘红酵母的草莓，其腐烂率与对照相比分别降低了95%和94.7%。范青O001)等对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明季也蒙假丝酵母(Pandidaguiliermondii),柠檬形克勒克酵母iKloGckerei、汉逊德巴利酵母iPebaryomyceshansenii)对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；Tian(2004)等研究，在甜樱桃采前喷洒1X108CFU/mL的丝孢酵母{Trichosporon//"^肅)，罗伦隐球酵母{Cryptococcuslaurentii)和红酵母(Mhodotorulaglutinis)，分别在25°C,0°C以及气调贮藏下，丝孢酵母在果实上繁殖数量最高，抑菌效果最好；张红印等000研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25°C下，梨灰霉病的发病率为16.7%，结合CaCl2使用效果更显著。从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于采后水果病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。为了尽快地将拮抗微生物应用于水果贮藏保鲜实际生产上，还需进一步筛选拮抗效果好、抗病谱广的微生物，并进一步提高拮抗酵母的拮抗效力，从而将其应用于水果贮藏保鲜。臭氧被广泛地应用于食品保鲜与加工领域。1997年，臭氧直接应用于食品领域获准了FDA的认可。2001年美国FDA又将抽样列入可以直接和食品接触的添加剂范围。据报道，臭氧可明显抑制灰葡萄孢霉(Botiytisci/^rea)、指状青霉iPenicilliimdigitatum)、竟、大私请毒、PeniciIliumiia/ic腫)、甸枝*艮霄{Rhizopusstolonifer)等致病菌孢子萌发。臭氧处理能明显减少葡萄草莓等果实的采后病害，品质指标没有不利影响个别指标反而有所增加。4本发明利用臭氧处理提高罗伦隐球酵母(frj^iococcmIaurentiη对草莓采后病害的生物防治效力，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。
发明内容本发明利用臭氧和罗伦隐球酵母结合使用来提高其对水果采后病害生物防治的效力。经臭氧处理和罗伦隐球酵母结合使用，可以明显地抑制水果病原菌，防治水果采后腐烂。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。本发明同时提供了臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法，按照下述步骤进行将罗伦隐球酵母(frj^iococcmIaurentiO活化，用NYDB培养基培养罗伦隐球酵母(frj^tococcmlmrentii\离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成IXlO8个/ml的菌悬液；将草莓放入塑料筐子中置于自制的塑料帐中，打开臭氧发生器通气30s；此时臭氧浓度为0.57%ig/ml，维持10min,臭氧处理后的草莓用1XIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。其中所述的NYDB培养基为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml,PH自然。本发明的优点(1)本发明所使用的罗伦隐球酵母(JJryptococcus皿iii)，其拮抗效力强，对人体无害。(2)本发明使用臭氧处理和罗伦隐球酵母结合使用，与单独使用臭氧处理或罗伦隐球酵母处理相比，可以显著提高罗伦隐球酵母(frj^iococcmIaurentiO的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。(3)本发明使用臭氧处理和罗伦隐球酵母结合使用可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。其中图1为臭氧与罗伦隐球酵母结合使用对草莓灰霉病的控制作用；注CK对照；臭氧臭氧通气30s维持10min；罗伦加入罗伦隐球酵母菌悬液；罗伦+臭氧臭氧通气30s维持10min，处理后通风加入罗伦隐球酵母菌悬液。发病率是20°C放置2d后测定的结果。不同字母代表差异显著性(P=0.05)。图2为臭氧与罗伦隐球酵母结合使用对草莓自然腐烂率的影响；注CK对照；臭氧臭氧通气30s维持10min；罗伦加入罗伦隐球酵母菌悬液；罗伦+臭氧臭氧通气30s维持10min，处理后通风加入罗伦隐球酵母菌悬液。不同字母代表差异显著性(p=0.05)。具体实施例方式通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。罗伦隐球酵母(frj^tococcmIaurentiO系购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，于NYDA(NYDB培养基的基础上添加H的琼脂(质量计))培养基4°C低温保存。培养程序为(1)固体活化将罗伦隐球酵母接种于NYDA培养基中，在培养48h；(2)液体培养在250ml的三角瓶中装入50ml的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的罗伦隐球酵母，在200rpm(转/分钟)条件下培养Mh；(3)离心分离再悬浮将酵母培养混合物在7000Xg条件下，离心10-15min，并用无菌蒸馏水洗涤2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为1XIO9个/ml，再用灭过菌的生理盐水稀释到所需浓度。实施例1臭氧与罗伦酵母结合使用对草莓果实灰霉病的控制作用一、试验方案供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均勻一致，表面无擦伤、机械伤和病虫伤害。将水果用无菌打孔器打孔(3X3mm)后接入5X104个/ml灰霉孢子，池后，进行以下处理(1)将草莓放入塑料筐子中置于自制的塑料帐中，打开臭氧发生器通气30s(此时臭氧浓度为0.574mg/ml)，维持10min,臭氧处理后的草莓用1XIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s，自然风干；(2)加入30ul罗伦酵母悬液(浓度为IXlO8个/ml)；(3)臭氧通气30s维持10min同时测定塑料帐中臭氧浓度；(4)不经任何处理。将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封，在20°C(RH95%)的恒温培养箱中培养。每处理重复3次，每次重复10个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养，记录果实发病率，以此评价罗伦隐球酵母(frj^tococcm的抑菌效果。发病率的计算公式如下发病率(%)=发病的果实/接种病原菌的果实总数X100%二、试验结果按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下从图1可以看出，臭氧和罗伦隐球酵母单独处理以及臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓果实灰霉病的抑制作用都显著好于对照处理。其中结合处理的效果是最好的，腐烂率最低为29.63%，显著低于对照处理的70.37%。臭氧和罗伦隐球酵母单独处理经过3天的培养，其腐烂率分别为48.15%和44.44%，均显著低于对照处理。实施例2臭氧与罗伦酵母结合使用对草莓果实自然腐烂率的影响一、试验方案将水果进行以下处理(1)将草莓放入塑料筐子中置于自制的塑料帐中，打开臭氧发生器通气30s(此时臭氧浓度为0.57%ig/ml)，维持10min,臭氧处理后的草莓用1XIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s，自然风干；(2)用IXIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s；(3)臭氧通气30s(臭氧浓度为0.57%ig/ml)，维持10min；(4)不经任何处理。然后，将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封，在20°C(RH95%)的恒温培养箱中贮藏3天和4°C冰柜中贮藏7天后转入20°C(RH95%)的恒温培养箱中贮藏1天，取出水果统计腐烂水果个数。每处理重复3次，整个实验重复2次。记录果实发病率，以此评价各个处理对草莓贮藏期病害的防治效果。发病率的计算公式如下发病率(%)=发病的果实/接种病原菌的果实总数X100%二、试验结果按照上述步骤试验，统计水果的自然腐烂率结果如下从图2可以看出经过臭氧和罗伦隐球酵母结合处理的草莓果实，不论是在20°C、湿度为95%的恒温恒湿培养箱中培养3天，还是在4°C7天后转入20°C培养1天，草莓果实的发病率为36.67%和20%，显著低于对照处理的66.67%和53.33%。在4°C7天后转入20°C培养1天后，罗伦隐球酵母单独处理的草莓果实自然腐烂率也显著低于对照处理。在20°C培养3天后，罗伦隐球酵母单独处理的草莓果实自然腐烂率也低于对照处理，但是差异不显-frh-者O实施例3臭氧与罗伦隐球酵母结合使用对草莓贮藏品质的影响一、试验方案将水果进行以下处理(1)将草莓放入塑料筐子中置于自制的塑料帐中，打开臭氧发生器通气30s(此时臭氧浓度为0.57%ig/ml)，维持10min,臭氧处理后的草莓用1XIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s，自然风干；(2)用IXIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s；(3)臭氧通气30s维持10min；(4)不经任何处理。然后，将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封，在20°C(RH95%)的恒温培养箱中贮藏3天和4°C冰柜中贮藏7天后转入20°C(RH95%)的恒温培养箱中贮藏1天，取出进行贮藏品质分析。贮藏品质分析方法如下(1)硬度采用ΤΑ-ΧΤ2质构分析仪(英国StableMicroSystems公司)测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的远行速度均为l.Omm/s，测试深度为10mm，探头插入水果时所受的最大阻力(单位为牛顿)就被定义为水果的硬度。每个处理重复4个水果。(2)总可溶性固形物采用WYT(0-80%)手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。(3)可滴定酸度(％):采用滴定法，从6个水果取样称取10g样品，加蒸馏水迅速研磨，定容至100ml容量瓶，过滤，取10mL滤液，用0.1mol/1NaOH进行滴定至PH8.1，滴定后进行计算，结果以含柠檬酸的百分数表示。(4)维生素C含量的测定采用2，6_二氯酚靛酚法法。从6个水果上取5g样品加5mL洲草酸研磨勻浆，倒入IOOml容量瓶，用1%草酸洗涤残渣，加Iml30%硫酸锌，摇勻。再加1ml15%亚铁氰化钾(除色素)，用1%草酸定容，摇勻过滤。取过滤液細1，然后向各管加入2，6-二氯酚靛酚染料溶液，随即加入二甲苯5ml，迅速摇动约0.5min，静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液在500nm波长下测定吸光度。根据测定液的光密度值查标准曲线，求出相应的Vc含量。二、试验结果按照上述步骤试验，统计草莓贮藏品质的结果如下表1臭氧与罗伦隐球酵母结合使用对草莓果实贮藏品质的影响注臭氧臭氧通气30s维持10min；罗伦加入罗伦隐球酵母菌悬液；罗伦+臭氧臭氧通气30s维持10min，处理后通风加入罗伦隐球酵母菌悬液。不同字母代表差异显著性(p=0.05)。由表1可知除20°C时单独使用罗伦隐球酵母和罗伦隐球酵母与臭氧结合使用时，可溶性固形物的含量和4°C时结合处理草莓果实的可滴定酸度明显高于对照处理外，其它方面都与对照相比无显著差异权利要求1.臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法，其特征在于按照下述步骤进行将罗伦隐球酵母(frj^iococcmhare/7iii)活化，用NYDB培养基培养罗伦隐球酵(^iyptococcushare/iii)，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1XIO8个/ml的菌悬液；将草莓放入塑料筐子中置于自制的塑料帐中，打开臭氧发生器通气30s；此时臭氧浓度为0.57%ig/ml，维持10min,臭氧处理后的草莓用1XIO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。2.臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH自然。全文摘要本发明公开了臭氧与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后病害防治的方法，属于水果采后生物防治领域。将罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)活化，接种到NYDB培养基中培养24h，离心得到菌体，将菌体用无菌水稀释制备成1×108个/ml的菌悬液；将草莓放入塑料筐子中置于自制的塑料帐中，打开臭氧发生器通气30s，此时臭氧浓度为0.574mg/ml，维持10min,臭氧处理后的草莓用罗伦隐球酵母菌悬液浸泡30s，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。本发明利用臭氧处理提高罗伦隐球酵母对草莓采后病害生物防治的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。文档编号A23B7/152GK102388955SQ20111036076公开日2012年3月28日申请日期2011年11月15日优先权日2011年11月15日发明者任晓锋,姜松,张红印,赵利娜,马龙传申请人:江苏大学