专利名称：拮抗结核分枝杆菌表面脂糖的核酸适配子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属微生物免疫和临床治疗领域，具体涉及一种能用于治疗和诊断由人结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis, H37Rv) [ATCC 93009(4)]导致的结核病的单链 DNA适配子，本发明还涉及该适配子的在诊断或治疗结核感染中的应用。
背景技术：
目前，结核病仍然是威胁人类生命健康的主要传染病之一，也是导致人类死亡的主要因素之一。据WHO统计，目前全球约20亿人感染结核，2008年全球约1110万人患有活动性肺结核，且约有180万人死于结核病。随着结核耐药菌株的不断出现，结核病的治疗面临巨大的挑战，全球范围急需开发新型的结核病治疗药物。结核病治疗方面，目前最常用的结核治疗药物利福平、异烟胼、链霉素、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇，虽然是目前有效的结核治疗药物，但利福平、异烟胼及吡嗪酰胺对患者都具有肝脏毒性，二者联合应用肝脏毒性更大(Capelle P，Dhumeaux D，Mora Μ, Feldmann G, Berthelot P.Effect of rifampicin on liver function in man.Gut. 1972,13 (5) 366-371)；链霉素虽然可以通过抑制蛋白质合成来有效的杀灭结核分支杆菌，但是该药物可造成不可逆的第八对脑神经损害，包括共济失调、眩晕、耳鸣、耳聋等，同时与其他氨基糖苷类相似，可引起肾脏毒性反应(Furst G, Maurer J, Schlegel J. Monitoring ototoxic side effects in streptomycin therapy of tuberculosis patients with transitory evoked otoacoustic emissions ΤΕ0ΑΕ. Pneumologie. 1995,49(11) :590-595)；而乙胺丁醇主要与异烟胼、利福平、吡嗪酰胺联合应用于治疗的强化期，但其毒副作用与其剂量成正比，可弓I起严重的视神经炎(Lim SA. “ Ethambutol-associated optic neuropathy“. Ann. Acad. Med. Singap. 2006，35 (4) :274-278)。同时，由于不规范用药等多种因素导致以上几种结核治疗药物耐药率越来越高。尽管不断有人进行新药物诸如mOXiflOXacin、R207910 的开发研制，然而目前新的抗结核病药物发展趋势总体较慢，急需研制新型抗结核药物。脂糖是结核分枝杆菌胞壁的主要成分，大约30%结核分枝杆菌基因参与了脂类的合成和代谢。甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(Mannosylated lipoarabinomannan, ManLAM)是主要存在于致病的人结核分枝杆菌胞壁中的脂糖。研究表明，脂糖ManLAM可以通过抑制树突状细胞(DC)的成熟、增加免疫抑制性细胞因子如白细胞介素IO(IL-IO) 的表达、抑制白细胞介素12(IL-12)的表达以及调节性T细胞的产生等一系列机制来抑制机体的免疫功會邑(Barnes PF, Roy S，et al. Mannose-capped lipoarabinomannan-and prostaglandin E2~dependent expansion of regulatory T cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. Eur J Immunol. 2008，38(2) :459-469)。SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)蹄选技术是90年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的单链随机寡核苷酸文库， 并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸配基，经过多轮筛选后获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers) (Stoltenburg R，Reinemann C，Strehlitz B.SELEX—a(r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol Eng. 2007,24(4) :381-403)，具有库容量大、亲和力高、靶分子范围广等优点，已成功运用于许多靶分子的筛选中，已经被广泛的应用于包括感染性疾病、肿瘤等的诊断制剂开发研究中，是极具诊断潜力的新型小分子制剂。本研究采用SELEX技术筛选获得了能与毒性结核分枝杆菌H37Rv表面脂糖ManLAM特异性结合的单链DNA适配子，通过封闭具有免疫抑制作用的ManLAM，逆转其免疫抑制效应，达到良好的治疗效果。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能与毒性结核分支杆菌H37Rv表面脂糖 ManLAM特异性结合的单链DNA适配子ZXLl。本发明的第二个目的在于提供上述DNA适配子在制备诊断结核病试剂中的应用；本发明的第三个目的在于提供上述DNA适配子在制备抗结核药物中的应用；本发明的目的还在于提供制备上述DNA适配子的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种能特异性结合毒性结核分支杆菌H37Rv的DNA适配子，其具有ZXLl所示的核苷酸序列。本发明通过随机单链DNA文库以及引物的构建、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测定、体外不同细菌结合实验等得到具有与毒性结核分支杆菌H37Rv高特异性、高亲和力的 DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。通过免疫学实验证实该适配子可以逆转 ManLAM导致的免疫抑制作用，动物实验证实该适配子具有很好的抗结核感染能力。此外，本领域技术人员可以在本发明SEQ ID No. 1的基础上，通过替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸，也能得到与本发明具有同等功能的适配子序列，例如SEQ ID No.5所示的序列。 另外，以SEQ ID No. 1为核心序列，按SEQ ID No. 2 (n30为SEQ ID No. 1所示的核心序列) 中SEQ ID No. 2由所述核心序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列。由此，本发明适配子包括DSEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1同等功能的序列；或，3)含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列，如SEQ ID No. 2由1)所述序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No. 2中的n30为1) 所述的核心序列。具体地，本发明采用下述方法获得特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv 的DNA适配子1、构建随机单链DNA(ssDNA)文库及引物构建长度88 个碱基的单链 DNA 文库5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAG TCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表A，T, C, G四个随机碱基。上游引物为 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，画线部分为 EcoRI 的 DNA 限制性酶切位点；下游引物为5，-GCGGGATCCTATGACGCATT GACCC-3’，画线部分为BamHI的DNA限制性酶切位点。随机单链DNA文库以及引物均可由公司合成。2、dsDNA及ssDNA文库的PCR扩增及保存
每一轮筛选前先将ssDNA文库扩增为dsDNA文库后保存，取少量dsDNA文库作为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应程序均为95°C 5min，95°C 36s,60°C 36s， 72°C 8 ，20-30个循环，72°C 5min。循环次数根据具体的扩增效果进行调整。PCR产物通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶纯化试剂盒进行回收(按照试剂盒产品说明书操作)。3、SELEX 筛选每轮筛选所用的ssDNA量均为40pmol，使用前置于85°C水浴10分钟后迅速冰浴 5min ；将提纯的毒性结核分支杆菌表面的脂糖ManLAM(按照参考文献的方法进行提取纯化)溶于包被缓冲液中包被96孔ELISA板，4°C过夜；使用筛选洗脱液反复洗涤6次后加入 40pmol的ssDNA文库，37°C孵育Ih后用筛选洗脱液洗涤6次；在筛选孔中加入100μ 1高压灭菌的双蒸水(ddH20)，95°C加热10分钟；将孔内ddH20吸至新的EP管中，然后加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc (3M)置于_70°C沉淀过夜，最后通过凝胶回收。上述筛选缓冲液为20mM pH 7. 4Tris · HCl, 137mM NaCl,5mM KCl,2mM CaCl2, ImM MgCl204、ManLAM梯度压力筛选为了获得高特异性结合的DNA适配子，选用ManLAM梯度筛选来增加筛选压力。前三轮用8 μ g的ManLAM，后续筛选逐渐降低ManLAM的用量，第4轮到第9轮用0. 8 μ g，第10 到第12轮ManLAM量降为0. 08 μ g。并从第5轮开始通过外周血单个核细胞(PBMC)进行反筛，第5至第7轮用IX IO6的PBMC反筛，第8至第10轮用5X IO6的PBMC反筛，第11、12 轮用1 X IO7的PBMC反筛。收集第4轮获得的ssDNA适配子40pmol，使用前置于85°C水浴 IOmin后冰浴5min ；将分离的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA适配子，37°C孵育Ih 后吸取上清液；然后将上清液重复步骤2与ManLAM进行作用。5、ssDNA适配子库与毒性结核分枝杆菌ManLAM的亲和力比较采用Elisa的方法测定每一轮的ssDNA和ManLAM的亲和力。具体方法如下用每一轮的dsDNA和生物素标记的引物2通过不对称PCR扩增大量的ssDNA适配子，然后琼脂糖凝胶电泳回收，测浓度后备用；用0. 8μ g的ManLAM包被ELISA板，4°C过夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS(PBST)洗6次；每孔加入含鲑鱼精DNA(100g/mL)的PBS 100 μ L进行封闭，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分别加入100 μ L含生物素标记的每一轮的生物素标记的ssDNA (40pmol),37°C, Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀释的HR标记的链霉亲和素 37°C，30min ；TMB 显色。通过检测，第12轮具有与ManLAM最高的亲和力，将第12轮ssDNA进行不对称PCR 扩增，得到dsDNA产物，经DNA限制性内切酶EcoRI以及BamHI消化后连接于质粒pUC19 载体(Yanisch-Perron, C.，1985)上，转化大肠杆菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通过氨苄青霉素进行抗性筛选，挑取单克隆，提取质粒后进行测序，得到上述的核苷酸序列(如SEQ ID No. 1所示)。进而，本发明提供上述DNA适配子ZXLl在制备诊断试剂中的应用。以ZXLl为模板，PCR扩增生物素以及荧光素(FAM)标记的适配子，然后采用E1ISA、流式细胞术以及激光共聚焦的方法测定与不同细菌的结和力。结果显示，ZXLl与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，与其它的分支杆菌及金黄色葡萄球菌等亲和力很低，与卡介苗以及无毒的耻垢分支杆菌亲和力很低。因而可以使用本发明适配子对结核分枝杆菌H37Rv进行检测，说 诊断是否感染结核菌。本发明还提供上述DNA适配子ZXLl在制备抗结核病药物中的应用。本发明研究表明将结核分枝杆菌与树突状细胞(DC)混合，单链DNA适配子ZXLl可以降低H37Rv导致的树突状细胞(DC)成熟的减少，同时增加IL-12的产生，降低IL-10的产生，说明该适配子能刺激细胞免疫；毒性结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠后，使用单链适配子ZXLl进行治疗，然后观察小鼠的生存情况，发现该适配子可以延长结核感染的小鼠的生存率；毒性结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠后经ZXLl治疗，发现适配子治疗组小鼠脾脏指数低于PBS对照组，说明该适配子能抗结核感染；抗酸染色证实，结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子 ZXLl作用后与未使用适配子组小鼠相比，小鼠肺脏的细菌载量明显减少，说明该适配子能抗结核感染；此外，结核分枝杆菌H37Rv感染的小鼠在适配子ZXLl作用后与未使用适配子组小鼠相比，小鼠肺脏及脾脏的病理改变明显较轻，说明该适配子能抗结核。因而，本发明适配子可以制成抗结核病的药物，用于预防或治疗结核分枝杆菌感染所引起的疾病。本发明ssDNA可以采用任何方法制备获得，例如包括不限于直接合成；通过不对称PCR得到；采用普通PCR方法，在任一引物上连接可分离标记(例如生物素标记)，获得 PCR产物后变性分离(例如采用生物素-亲和素系统分离)。本发明的优点和效果一、筛选获得的ssDNA适配子可特异性与毒性结核分枝杆菌H37Rv表面ManLAM 结合，可以直接封闭ManLAM的免疫抑制作用。适配子制备简单，价格低廉，确保了获得的 ssDNA适配子特异性的结合在毒性结核分枝杆菌表面，进一步提高了治疗的靶向性。二、为克服临床上结核治疗出现的日益严重的耐药问题和副作用大的问题提供了新的解决思路。本发明制备的针对毒性结核分支杆菌表面ManLAM的ssDNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同于广谱抗生素，无耐药的可能；同时它只针对结核分支杆菌发挥作用，对益生菌无害。三、免疫学实验证实该适配子可以有效的逆转ManLAM所致的免疫抑制作用，具有治疗结核病效果。四、动物实验结果可见，小鼠行毒性结核分枝杆菌攻毒后，用ssDNA适配子处理后的小鼠生存率明显延长，肺脏菌落明显少于对照组，脾脏、肺脏病理变化也较对照组轻，说明ssDNA适配子可以有效的降低结核分枝杆菌的感染，延长结核感染小鼠的生存时间。此外，该适配子已经克隆到PUC19载体上，且已经转化至大肠杆菌Dffia中，可以直接通过该菌种进行大量制备该适配子。总而言之，本发明提供的DNA适配子与毒性结核分支杆菌作用特异性高，亲和力强，为结核病的诊断提供了新型的制剂。克服了临床上对结核抗原诊断的非特异性、不灵敏性以及周期长的缺点，为结核病的诊断和治疗提供了一种新的途径。
图1. SELEX技术筛选特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv表面ManLAM的ssDNA 适配子扩增结果图。用合成的随机ssDNA文库与ManLAM进行作用，去掉未结合的部分，第5轮开始通过PBMC进行反筛，共筛选12轮。每轮筛选前将ssDNA文库扩增为dsDNA文库，保存，以dsDNA文库为模板扩增下一轮ssDNA文库。图2.等温滴定法测定ZXLl与ManLAM的亲和力结果示意图。以0rigin6. 0软件对ZXLl和ManLAM作用的稀释热进行双位点模型非线性最小方差拟合，得到本征结合常数Ka0 ZXLl与ManLAM结合常数为Ka :5. 27 X IO5 (士2. 9 X IO3)M-1， 而对照适配子ZXL4与ManLAM几乎没有亲和力。图3.表面等离子共振技术(SPR)测定单链DNA适配子ZXLl与ManLAM的亲和力结果示意图。以BiacoreTlOO软件对ZXLl和ManLAM作用进行拟合，得到二者的解离常数KD值， 适配子ZXLl与ManLAM作用的解离常数KD值为8. 907 X 1θΛ 。图4Α、4Β.适配子ZXLl与不同细菌亲和能力大小的结果示意图。以ZXLl为模板，PCR扩增生物素以及荧光素(FAM)标记的适配子，然后采用 E1ISA、流式细胞术以及激光共聚焦的方法测定与不同细菌的结和力。图4Α显示，ZXLl与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，与其它的分支杆菌及金黄色葡萄球菌等亲和力很低；4Β显示，ZXLl与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力，而与卡介苗以及无毒的耻垢分支杆菌亲和力很低。图5. ZXLl在结核病诊断中的应用结果示意图。图6Α、6Β.适配子ZXLl逆转ManLAM所致的免疫抑制作用结果示意图。将结核分枝杆菌与树突状细胞(DC)混合，单链DNA适配子ZXLl可以降低H37Rv 导致的树突状细胞(DC)成熟的减少，同时增加IL-12的产生，降低IL-10的产生，说明该适配子能刺激细胞免疫。图7.适配子ZXLl延长结核分枝杆菌感染小鼠的生存率结果示意图。毒性结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠后，使用单链适配子ZXLl进行治疗，然后观察小鼠的生存情况，发现该适配子可以延长结核感染的小鼠的生存率。图8.适配子ZXLl降低结核感染小鼠脾脏重量指数结果示意图。毒性结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠后经ZXLl治疗，发现适配子治疗组小鼠脾脏指数低于PBS对照组，说明该适配子能抗结核感染。图9.结核感染恒河猴适配子ZXLl治疗示意图。图9A-B结核感染恒河猴血液学变化；图9C适配子ZXLl治疗组肺脏中结核荷菌量明显少于PBS对照组。
具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例IDNA适配子的筛选本发明可以特异性结合毒性结核分枝杆菌H37Rv的DNA适配子，按照下列步骤筛选获得1、构建随机单链DNA文库及引物构建长度88 个碱基的单链 DNA 文库5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAG TCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGT CATA-3’，其中N代表A，T，C，G四个随机碱基。上游引物为5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，画线部分为 EcoRI 的 DNA 限制性酶切位点；下游引物为5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，，画线部分为BamHI的DNA限制性酶切位点。随机单链DNA文库以及引物均可由上海博亚生物有限公司合成。2、dsDNA及ssDNA文库的PCR扩增及保存每一轮筛选前先将ssDNA文库扩增为dsDNA文库后保存，取少量dsDNA文库作为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应程序均为95°C 5min，95°C 36s,60°C 36s， 72°C別s，20-30个循环，72°C 5min，均参照IBM公司Klenow Fragment产品说明书进行。 PCR产物通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶纯化试剂盒进行回收。3、SELEX 筛选每轮筛选所用的ssDNA量均为40pmol，使用前置于85°C水浴10分钟后迅速冰浴 5min ；将提纯的毒性结核分支杆菌表面的脂糖ManLAM(按照参考文献的方法进行提取纯化)溶于包被缓冲液中包被96孔ELISA板，4°C过夜；使用筛选洗脱液反复洗涤6次后加入 40pmol的ssDNA文库，37°C孵育Ih后用筛选洗脱液洗涤6次；在筛选孔中加入1001高压灭菌的双蒸水(ddH20)，95°C加热10分钟；将孔内ddH20吸至新的EP管中，然后加入2倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc (3M)置于_70°C沉淀过夜，最后通过凝胶回收。上述SELEX 筛选缓冲液为20mM pH 7.4 Tris · HCl，137mM NaCl, 5mM KCl,2mM CaCl2, ImM MgCl2。4、ManLAM梯度压力筛选为了获得高特异性结合的DNA适配子，选用ManLAM梯度筛选来增加筛选压力。前三轮用8 μ g的ManLAM，后续筛选逐渐降低ManLAM的用量，第4轮到第9轮用0. 8 μ g，第10 到第12轮ManLAM量降为0. 08 μ g。并从第5轮开始通过外周血单个核细胞(PBMC)进行反筛，第5至第7轮用IX IO6的PBMC反筛，第8至第10轮用5X IO6的PBMC反筛，第11、12 轮用1 X IO7的PBMC反筛。收集第4轮获得的ssDNA适配子40pmol，使用前置于85°C水浴 IOmin后冰浴5min ；将分离的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA适配子，37°C孵育Ih 后吸取上清液；然后将上清液重复步骤2与ManLAM进行作用。5、ssDNA适配子库与毒性结核分枝杆菌ManLAM的亲和力比较采用ElISA的方法测定每一轮的ssDNA和ManLAM的亲和力。具体方法如下用每一轮的dsDNA和生物素标记的引物2通过不对称PCR扩增大量的ssDNA适配子，然后琼脂糖凝胶电泳回收，测浓度后备用；用0. 8μ g的ManLAM包被ELISA板，4°C过夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔加入含鲑鱼精DNA (100 μ g/mL)的PBS 100 μ L进行封闭，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分别加入100 μ L含生物素标记的每一轮的生物素标记的ssDNA(40pmol)，37°C, Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀释的HR标记的链霉亲和素 37°C，30min ；TMB 显色。通过检测，第12轮具有与ManLAM最高的亲和力，将第12轮ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA产物，经DNA限制性内切酶EcoRI以及BamHI消化后连接于质粒pUC19载体(Yanisch-Perron，C.，1985)上，转化大肠杆菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通过氨苄青霉素进行抗性筛选，挑取单克隆，提取质粒后进行测序，得到SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列 (命名为ZXL1)。6、等温滴定法测定ssDNA适配子与ManLAM的亲和力
将测序得到的ssDNA适配子通过等温滴定法测定与ManLAM的亲和力，37°C时适配子与ManLAM相互作用的热力学性质的测定在美国MicroCal公司生产的VP型等温滴定量热仪上进行。滴定实验中，将ManLAM溶液装入250 μ L的滴定注射器，适配子溶液放入1. 43ml 的样品池，搅拌器以200r/min的速度搅拌，每间隔300s加入10 μ 1的ManLAM溶液到适配子溶液中，共滴25次。参比池中加入去离子水作为样品池的热平衡参照。另做一空白实验以扣除ManLAM溶液稀释热的影响，即在样品池中加入缓冲液，用ManLAM溶液滴定。ManLAM 溶液的稀释热经测定非常小，可略去。所有的溶液都在相应温度条件下真空脱气处理以减小信号噪音，积分每个峰面积并扣除稀释热后得到结合反应热，对适配子与ManLAM的摩尔比作图得到反应等温线。以MicroCal公司提供的Origin 6. O软件中的两结合位点模型进行非线性最小方差拟合，可计算出二者作用的本征结合常数Ka。如图2所示，以0rigin6. O软件对ZXLl和ManLAM作用的稀释热进行双位点模型非线性最小方差拟合，得到本征结合常数Ka。ZXLl与ManLAM结合常数为Ka: 5. 27X 105(士2. 9X lO^M—1，ZXLl该序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1类似空间结构或同等功能的序列，如ZXL2(序列为:5，-ggccggatag cgacggggcc attccaagaa-3')，其与ZXLl具有类同等功能，具有与ManLAM的高亲和力的结合常数(Ka 5. 03x104M_1)(如图 2A)，而对照适配子 ZXL4 (序列为5，-CACGCCCAATAGTGGCTC CAGCTCATCTCT)与ManLAM几乎没有亲和力(如图2)。7、表面等离子共振技术(SPR)测定DNA适配子ZXLl与ManLAM的亲和力大小将亲和力最高的单链DNA适配子ZXLl通过表面等离子共振技术(SPR)测定与 ManLAM的亲和力大小。该亲和力测定在Biacore TlOO表面等离子共振仪上进行。实验中， 将252Ru的适配子ZXLl固定在knsor Chip CM5芯片(购自Biacore AB)的Fc4通道上， Fc3通道加不同浓度的ManLAM (浓度分别为0、0. 5Χ1(Γ7Μ、1Χ1(Γ7Μ、2Χ1(Γ7Μ、4Χ1(ΓΜ)，进样速度为30μ Ι/min，进样时间为lmin。如图3所示，将反应数据通过Biocore TlOO软件进行拟合，得到适配子ZXLl与ManLAM结合的解离常数KD值为8. 907X10—1。实施例2适配子ZXLl与不同细菌的结合力大小检测用生物素标记的下游引物(5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’)通过不对称PCR 扩增获得大量的生物素标记的ssDNA适配子，按照每孔IXlO5的不同细菌包被ELISA板，4°C 过夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔加入含鲑鱼精DNA(100 μ g/mL) 的PBS 100 μ L进行封闭，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分别加入100 μ L含生物素标记的每一轮的生物素标记的ssDNAGOpmol)，37°C，Ih;用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀释的HR标记的链霉亲和素37°C，30min ；TMB显色。流式细胞术检测适配子ZXLl与毒性结核分枝杆菌H37Rv、卡介苗以及耻垢分枝杆菌的结合力大小。首先通过荧光FAM标记的下游引物不对称扩增大量FAM标记的适配子 ZXLl，取上述三种细菌，调整浓度至lX107ml，分别取100 μ 1细菌于EP管中，75%乙醇固定 15min后PBS洗3次，每管加入4 μ g带有荧光标记的单适配子，混勻，于37°C孵育2小时。 PBS洗3次后上机检测。激光共聚焦显微镜测定适配子ZXLl与毒性结核分枝杆菌H37Rv以及卡介苗BCG 的结合力。首先制备FAM标记的适配子ZXLl，取H37Rv及BCG两种细菌调整浓度至IXlO4/ml，分别取1001均勻的涂布在包有多聚赖氨酸的载玻片上，自然晾干，PBS洗3次，将FAM 标记的适配子ZXLl均勻的滴在涂有细菌的载玻片上，于37°C孵育池后PBS洗3次上机检测。结果如图4所示，图4A显示，ZXLl与毒性结核分枝杆菌H37Rv具有最高的亲和力， 与其它的分支杆菌及金黄色葡萄球菌等亲和力很低；图4B显示，ZXLl与毒性结核分枝杆菌 H37Rv具有最高的亲和力，而与卡介苗以及无毒的耻垢分支杆菌亲和力很低。表明，本发明适配子具有良好的特异性。实施例3ZXL1在结核病诊断中的应用收集结核病人的血清(武汉市医疗救治中心，其中急性未经治疗的结核病患者17 例，反复多次住院化疗的结核病人18例，男性患者M例，女性患者11例，患者最小年龄为 11岁，最大年龄为57岁)及14例健康志愿者血清(武汉大学中南医院检验科)。在酶标板孔中加入血清样品包被，并加入通过生物素标记的适配子ZXL1，加入 HRP标记的链酶亲和素，37°C孵育1小时；PBS洗三次后加入TMB进行显色5分钟；2M硫酸终止反应后酶标仪读数；进行检测，结果如5所示，与健康志愿者相比，结核病患者血清中 ManLAM抗体的0D450均明显升高(p = 0. 0023)。结果证明ZXLl在结核病诊断中具有应用前景。实施例4适配子ZXLl对ManLAM所致的免疫抑制作用的影响流式细胞术检测ZXLl对ManLAM作用的DC细胞成熟的影响。首先无菌分离新鲜的人外周血单个核细胞，使用CD14+的磁珠分选出CD14+的细胞，计数后于6孔细胞培养板中培养，隔日更换含有IL-4和GM-CSF的1640培养基，2天后加入ManLAM，7天后加入脂多糖(LPQ刺激成熟。实验分组分别为培养基对照组、LPS刺激组、LPS+ManLAM组以及 LPS+ManLAM+ZXLl组。最后分别收集培养上清及每组细胞，将收集的细胞分别用荧光标记 ⑶80、⑶83以及⑶86抗体进行标记，流式检测三种分子的表达水平。酶联免疫吸附检测法(ELISA法)检测培养上清中IL-10以及IL-12的表达。如上，在培养的DC细胞中分别加H37Rv、BCG以及ManLAM，收集上清后，采用eBiosicence (San Diego, CA)的IL-10以及IL-12细胞因子检测试剂盒，ELISA检测IL-10和IL-12的表达水平。结果如6所示，单链DNA适配子ZXLl可以降低H37Rv导致的树突状细胞(DC)成熟的减少，同时增加IL-12的产生，降低IL-10的产生，说明该适配子能刺激细胞免疫。实施例5动物实验用IO7CFU的H37R结核菌感染小鼠，小鼠分6组，每组6只，第一组小鼠感染后作磷酸缓冲液(PBQ处理，第二组小鼠感染后行链霉素治疗，第三组为不相关适配子(ZXL4)对照组，第四组 第六组为不同剂量ZXLl治疗组(分别为5 μ g、10 μ g、15 μ g)。感染后三天开始治疗，每隔三天注射一次，共注射三次。所有小鼠均为尾静脉注射，实验前H37Rv均经过小鼠体内传代，以保证足够的毒力。动物实验证明，筛选获得的ssDNA适配子ZXLl可以明显延长结核感染小鼠的生存率，脾脏指数较PBS对照组明显减小，降低结核分枝杆菌感染后小鼠肺脏的荷菌量，明显减轻感染小鼠肺脏及脾脏的病理变化。由此可见，本发明适配子可以制备成抗结核病的药物， 用于防治结核菌感染所引起的疾病。
另外，本发明还对恒河猴进行了治疗实验，恒河猴结核感染模型前期实验数据证实适配子ZXLl也具有一定的结核治疗作用，与PBS对照组相比，适配子治疗组恒河猴血沉、 急性反应蛋白、体重均未见明显异常，肺部X线表现轻于PBS对照组；同时肺组织、外周淋巴结组织病理变化轻于PBS对照组，且与链霉素治疗组无明显差异。申请人:还进一步对由ZXLl所衍生的序列进行了上述实施例2 5的相关实验，结果表明，这些衍生的也具有同等的功能。这些序列包括1)SEQ ID No. 5 所示的序列；2) SEQ ID No. 2 (n30 为 SEQ ID No. 1 及 5)所示的序列；3)上述2)的序列由SEQ ID No. 1所示序列向5’端延伸5个核苷酸所得到的序列；4)上述2)的序列由SEQ ID No. 5所示序列向3，端延伸10个核苷酸所得到的序列；5)上述2)的序列由SEQ ID No. 1所示序列向5’端延伸12个核苷酸向3’端延伸 8个核苷酸所得到的序列。
权利要求
1.一种拮抗结核分枝杆菌表面脂糖的核酸适配子，其核苷酸序列为1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经替换、缺失和/或者插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1同等功能的序列；或，3)含有SEQID No. 1所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列，如SEQ ID No. 2 由1)所述序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No. 2中的n30为1)所述的核心序列。
2.权利要求1所述核酸适配子在制备结核病诊断试剂中的应用。
3.含有权利要求1所述核酸适配子的诊断试剂。
4.权利要求1所示的核酸适配子在制备预防或治疗结核病药物中的应用。
5.一种抗结核病药物，其含有权利要求1所述的核酸适配子。
6.制备权利要求1所述核酸适配子的方法，其采用1)人工合成；2)不对称PCR；或，3)采用PCR法，在其中一个引物中引入生物素标记，PCR产物变性后用亲和素分离。
全文摘要
本发明公开了一种拮抗结核分枝杆菌表面脂糖的核酸适配子及其用途。该适配子是针对毒性结核分枝杆菌表面脂糖ManLAM的并具有抗结核感染和增强细胞免疫功能的小分子单链DNA(ssDNA)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该小分子单链DNA具有与传统抗结核药物不同的新靶点和新结构，具有直接封闭ManLAM的免疫抑制作用。该适配子制备简单，价格低廉，确保了获得的单链DNA适配子特异性的结合在毒性结核分枝杆菌表面，进一步提高了治疗的靶向性。克服了传统上结核治疗出现中日益严重的耐药问题和副作用大的问题，可作为一种有效的新型抗结核药物或结核病诊断试剂。
文档编号C12R1/32GK102373213SQ20111036198
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者潘勤, 王其龙, 章晓联 申请人:章晓联