专利名称：一种肌内脂肪沉积scd基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与猪肌内脂肪沉积相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase, SCD)基因技术。
背景技术：
近年来，由于猪的选育工作中过度追求高瘦肉率，导致猪肉品质的严重下降。肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)是影响肉品质的重要因素，与猪肉嫩度、风味及营养密切相关，目前已得到越来越多的认识和重视。肌内脂肪的脂肪酸组成不仅影响猪肉的风味，也是影响人类健康的关键因素之一。人们如果过多摄入饱和脂肪酸，则会增加患心血管疾病的风险。相反，如果摄入较多的单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)则会增加肝脏低密度脂蛋白(LDL)受体活性，从而减少血液中低密度脂蛋白胆固醇浓度。
硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase, SCD)是单不饱和脂肪酸生物合成的限速酶，它能够催化饱和的棕榈酸(16:0)和十八碳硬脂酸(18:0)生成单不饱和的棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)。近来研究发现，S⑶的mRNA表达受到固醇调节元件结合蛋白(SREBP)I和多不饱和脂肪酸(PUFA)含量的调控，也是瘦素(1印tin)发挥代谢作用的一个重要元件，Ieptin通过抑制S⑶的活性而发挥生理功能，即增加能量消耗降低体脂沉积。SCD活性降低时，抑制了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的活性，导致脂肪酸从头合成减少， 同时使肉碱棕榈酰基转移酶(CPT)I的活性增强，线粒体β氧化增加，导致脂肪消耗增加， 因此脂肪沉积减少。来源于饲粮或体内从头合成的饱和脂肪酸经过内质网上SCD的去饱和作用，变成单不饱和脂肪酸，再由二酰甘油转乙酰基酶(DGAI02进一步合成甘油三酯。所以由SCD生成的内源性单不饱和脂肪酸为甘油三酯的合成提供了重要的合成底物。
迄今为止，S⑶基因在鼠、人、牛、羊等多物种中的结构、组织分布、功能及表达调控等方面的研究均已取得了一系列的进展，但SCD对动物肉质的影响方面的报道还不是很多。进一步研究SCD的遗传变异和表达与肉质相关性及对脂肪沉积的影响等有着非常重要的意义。发明内容
本发明的目的是提供一种肌内脂肪沉积SCD基因，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现SCD基因参与肌内脂肪细胞脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 SCD基因。
一种肌内脂肪沉积SCD基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)基因，基因的CDS 序列全长为1080bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1。并且，⑶S核苷酸序列编码359个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积SCD基因设计引物，进行PCR扩增，检测S⑶基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示S⑶基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明S⑶基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
猪是脂肪沉积型动物，其脂肪沉积能力在不同品种之间变化很大。我国一些肉质优良的地方猪种是最宝贵和稀缺的基因资源，这在优质猪肉的培育中有独特的利用价值。 版纳微型猪是云南省优良的地方猪种，具有耐粗饲、适应性强、肉质优良、肌内脂肪丰富，肌纤维细密，肉质鲜嫩等优良特性。然而，目前对版纳微型猪的生长发育及肌内脂肪沉积的分子机制知之甚少。近年来，本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现SCD基因参与肌内脂肪细胞的脂类代谢过程， 并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 SCD基因。因此，研究版纳微型猪SCD基因的序列与表达模式，分析其核苷酸和氨基酸序列结构，从分子水平了解版纳微型猪肌内脂肪沉积较多的特点，为进一步研究该基因的功能及为改善猪胴体脂肪性状及肉品质的育种工作提供理论基础。
SCD是脂肪细胞的特征性基因，与肌肉组织中肌内脂肪沉积有关。本发明克隆得到版纳微型猪S⑶基因⑶S全序列，全长为1080bp，提交到Genbank，登录号为JN613^7。与 Genbank提供的猪S⑶基因相比较，没有发现突变位点，氨基酸序列也无变化。因此，S⑶基因促进脂肪沉积的生物学功能可能与版纳微型猪优良肉品质的特点有关。
SCD蛋白在物种间的同源性较高，通过进化树可以看出，猪与羊的亲缘性较近，其次是牛、人、大鼠。猪SCD的氨基酸序列与牛、羊、人和大鼠的同源性分别为88%、88%、86%和 82%。SCD蛋白在不同物种间的高度保守性提示了该基因在各个物种中保持相应不变的生理特点的分子基础。另外，SCD在脂肪组织中的高度表达，也证明了它在肌内脂肪沉积方面具有重要作用。
图1是本发明的PCR扩增S⑶基因图示。
图2是本发明的S⑶在不同组织中的表达水平柱图。
图3是本发明的S⑶基因酶切鉴定图示。
图4是本发明的进化树分析图。
图5是本发明的SCD蛋白二级结构预测图。
图6是本发明的SCD蛋白质磷酸化位点预测图。
图7是本发明的SCD蛋白糖基化位点预测图。
图8是本发明的SCD蛋白质疏水性分析图。
图9是本发明的SCD蛋白质跨膜区预测。
图10是本发明的SCD蛋白质跨膜螺旋预测图。
具体实施方式
一种肌内脂肪沉积SCD基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase，SCD)基因，其特征在于 基因的⑶S序列全长为1080bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1。并且，⑶S核苷酸序列编码359个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
对上述特征的肌内脂肪沉积SCD基因设计引物，进行PCR扩增，检测SCD基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示SCD基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明SCD基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
1、肌肉组织中总RNA的提取采取50kg成年版纳微型猪肌肉组织立即放入液氮中保存备用。利用RNA提取试剂提取版纳微型猪肌肉组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行。将提取的RNA反转录成 cDNA，_20°C保存，待用。
2、PCR引物设计及PCR反应条件根据 GenBank 中猪 SCD 序列信息(GenBank 登录号 NM-213781. 1 )，利用 Primer Premier 5.0设计引物，并合成。
用于克隆的S⑶基因的引物序列为F 5' - CAG TGC GGT CTG CCA CGA AC -3， R :5’ - GAA CCC AAG GGA CCC CAA ACT C -3， 用于荧光定量的SCD基因的引物序列为 F 5' - TCT GGG CGT TTG CCT ACT ATC T -3， R 5' - TCT TTG ACG GCT GGG TGT TT -3， 内参18S rRNA的引物序列为 F 5' -CTG CCT TCC TTG GAT GTG -3， R :5’ -GCG GCT TTG GTG ACT CTA -3，SCD基因克隆的PCR反应条件为94°C预变性％iin;94°C变性40s、53°C退火40s、 72°C延伸;3min 30个循环；72°C后延伸7min进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定其亮度和特异性。通过PCR扩增，得到了长度为1173bp的片段。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增的产物的长度大小同于目的片段大小。
荧光定量PCR的反应条件为94°C预变性；3min;94 °C变性30 s，53°C退火30s、 72°C延伸30 8，39个循环；721后延伸7min进行扩增。数据处理的方法为，检测心、肝、 脾、肺、肾、肌肉、脂肪七个组织中S⑶基因的相对表达量，实验数据以18S rRNA作为内参， 采用双标准曲线法处理。结果显示，S⑶在被检测的7个组织中都有表达，在脂肪中表达量最高，在肺、脾、肾中大量表达，在心和肝中少量表达，在肌肉中微量表达。
3、S⑶基因的克隆及序列分析按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒书说明书回收特异性条带，产物连接于pMD-18T载体，转化至ToplO感受态细胞，氨苄筛选挑取阳性克隆，分别接种于IOmL LB液体培养基中， 37 °C振荡过夜，送菌液进行测序。
4、测序结果S⑶基因核苷酸⑶S全长1080bp，核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 1所示，并提交到Genbank数据库，登录号为JN613^7。⑶S序列编码359个氨基酸， 其氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。
5、测序结果与Genbank中提供的序列比对登录http //www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪的核苷酸序列同 GeneBank中猪S⑶基因(登录号为NM-213781. 1)的⑶S序列进行序列比对。没有发现⑶S 的核苷酸序列有突变位点，因而没有导致氨基酸序列发生相应的突变。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。
6、S⑶基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析登录http://WWW. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪SCD基因测序结果与牛(登录号为NM_173959. 4)、人(登录号为NM_005063. 4)、羊(登录号为NM_001009254. 1)和大鼠(登录号为NM_031841. 1)SCD基因的核苷酸和氨基酸序列比对分析，结果显示版纳微型猪与牛、羊、人和大鼠的S⑶基因的⑶S序列同源性分别为90%、90%、87%和83% ；⑶S序列所编码氨基酸的同源性分别为88%、88%、86%和82%。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。
7、S⑶基因的进化树分析利用Meg4软件的邻近(Neighbor-joining)方法构建版纳微型猪(Genbank登录号JN613287)、牛(登录号为NM_173959. 4)、人(登录号为NM_005063. 4)、羊(登录号为 NM_001009254. 1)和大鼠(登录号为NM_031841. 1)S⑶蛋白的系统进化树，结果显示版纳微型猪与羊的亲缘性较近，其次是牛、人、大鼠。
8、S⑶蛋白分子量、等电点预测分析使用ExPASy的在线软件Compute pI/MW分析版纳微型猪S⑶蛋白的等电点(pi)为 9. 23、理论分子量(pW)为 41375. 77 Da。
9、S⑶蛋白质二级结构预测分析登陆http://bi0inf. cs. ucl. ac. uk/psipred/，对版纳微型猪硬脂酰辅酶A去饱和酶蛋白质二级结构进行预测，共有159个螺旋、8个伸展链和192个卷曲结构。
10、S⑶蛋白质磷酸化位点预测登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/，对猪 SCD 蛋白质磷酸化位点进行预测，结果显示，共有16个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有9个、苏氨酸磷酸化位点有1个、酪氨酸磷酸化位点有6个。
11、S⑶蛋白质糖基化位点预测登录 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/，对版纳微型猪 FAP-I 蛋白糖基化位点预测，结果显示S⑶蛋白共有3个糖基化位点，分别在第201、259和318位。
12、S⑶蛋白质疏水性分析登陆http://web. expasy. org/protscale/，对SCD蛋白质疏水性进行分析，结果显示为亲水性蛋白。
13、S⑶蛋白质跨膜区预测登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/，对 SCD 蛋白质跨膜区进行分析， 结果显示有4个跨膜区，跨膜的氨基酸序列分别为第71位至93位、第98位至120位、第 217位至236位和第251位至273位。
14、S⑶蛋白质跨膜螺旋预测登陆 http://www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html，对 SCD 蛋白质的跨膜螺旋进行分析，结果显示SCD蛋白有5个跨膜螺旋，方向从内到外的跨膜螺旋的氨基酸序列分别为第77位至96位、第101位至117位、第220位至237位、第246位至271位和第317位至3；34位。
权利要求
1.一种肌内脂肪沉积SCD基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)基因，其特征在于 基因的⑶S序列全长为1080bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1，并且，⑶S核苷酸序列编码359个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根据权利要求1所述一种肌内脂肪沉积SCD基因，其特征在于对上述特征的肌内脂肪沉积SCD基因设计引物，进行PCR扩增，检测SCD基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示SCD基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明SCD基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
全文摘要
本发明公开一种肌内脂肪沉积SCD基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoAdesaturase,SCD)基因，基因的CDS序列全长为1080bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列编码359个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。检测SCD基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示SCD基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明SCD基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
文档编号C12N15/53GK102533805SQ20111041841
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者杨明华, 潘洪彬, 王静, 赵素梅, 高士争, 黄英 申请人:云南农业大学