专利名称：一种生产非人哺乳类转基因动物的方法
技术领域：
本发明属于转基因动物育种技术领域，具体涉及一种生产非人哺乳类转基因动物的方法。
背景技术：
转基因动物制备技术是当前生命科学领域中热点之一，目前国际上在转基因动物制备方面的主要策略从以下三个方面即处理受精卵、卵子和精子来获得转基因动物。鉴于卵子和精子处理方法的不稳定性，故而在转基因动物制备中，对于受精卵处理法仍然是最有效、最经典的方法，原核期显微注射外源DNA法(Gordon Jff, Scangos GA, Plotkin DJ,Barbosa JA, Ruddle FH. Genetic transformation of mouse embryos by microinjectionof purified DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Dec ；77 (12) :7380-4.)。该方法在小鼠上较为成功，但对于大动物(牛、羊、猪等)成功率极低，仅为0.3 1%。尽管有一些研究者对此方法作了些改进，取得了一些进展，如美国专利4736866 (1984年)和4873191 (1986年)。但是该方法存在不可避免的缺陷需要利用显微操作系统，将外源DNA精确的注入受精卵中的雄原核中，其不可避免会对早期胚胎造成损伤，且外源基因整合效率随机不定，整体效率很低。这都造成了该法制备转基因动物成本较高，如国外制备一头转基因牛需要约50万美元。胚胎干细胞技术是继原核显微注射后被广泛研究的转基因技术之一，该方法利用胚胎干细胞的具有的全能性，既可以发育成一个个体的能力，将分离获得的重组胚胎干细胞转入外源基因后，直接移入受体动物，获得转基因动物，由此看来，该方法的关键之处是首先要建立由胚胎干细胞系，便于获得还有目标基因的阳性胚胎干细胞。但是目前为止，只有小鼠的胚胎干细胞获得成功建系，且有欧洲专利建立体外胚胎干细胞建系方法来制备转
云力· (W02008017704 =Method Of Production Of Transgenic Avian Using EmbryonicStem Cells)。而其他大动物，如猪、牛、羊很难获得胚胎干细胞系，所以限制大动物转基因动物的制备。结合核移植技术可以使解决胚胎干细胞来源的不足，近年来取得了很多成功的石if究 艮道(Machaty Z，Bondioli KR, Ramsoondar JJ, Fodor WL. The use of nucleartransfer to produce transgenic pigs. Cloning Stem Cells. 2002 ；4(1) :21-7.)，但是，该方法前期细胞筛选操作工作量大，最终容易产生嵌合体，从而增大了转基因动物制备的成本。转基因动物制备中最关键环节之一便是外源基因的导入，最早的玻璃管直接注射是一种简便的方法，但是对受精卵损伤很大，且操作需要昂贵仪器以及操作复杂；故直接通过构建含有外源基因的载体是一种非常有效的手段之一。尽管常用的细胞导入方法很多，但是由于受精卵的特殊性，它具有很厚的细胞膜，即透明带组织，故常用的方法(如磷酸钙法、电击法、脂质体法)较难以对其操作，获得成功的目标基因导入。近年来，病毒转染技术被认为是转染效率最高的外源目标基因导入技术，可实现100%的目标基因的导入。但目前病毒转染方法中主要是应用逆转录病毒法来制备转基因动物，逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒(defectivevirus)使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把外源目标基因转入了人体细胞，并在细胞中表达。逆转录病毒的许多特点使其成为转基因载体的上佳选择。最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。尽管逆转录病毒曾被广泛应用于人类基因治疗和转基因动物的制备，但是该法有其局限性，首先，该体系允许装入的外源基因大小受到限制，也就是逆转录病毒载体系统包装外源基因的能力有限，不能超过4Kb;其次，该系统包装的目标基因要求最好不要含有内含子序列，从而限制了目标基因的有效调控表达；最重要的是逆转录病毒整合到宿主染色体后容易生成野生型病毒颗粒，还会激活原癌基因，造成宿主安全性问题。综上所述，目前国际上，并没有找到一种简便、高效的转基因方法。由此，我们以构建的真核质粒为载体，以多种目的基因(包括绿色荧光蛋白基因基因、DMRT、LTF)为例，采用脂质体转染技术，进行了转基因牛、羊、猪、兔子的制备，并探索出了一种更加简便、高效率的转基因动物的方法。所制备的转基因动物可应用于动物新品种培育、疾病模型、生物制药以及基因功能确证等研究和应用。在常规方法中，脂质体转染技术被认为是一种简便、有效的基因导入方法之一(Feigner et al. Lipofection -.a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfectionprocedure [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,84 :7413-7417)，但是在制作转基因动物研究中，耿利英等对于卵母细胞的转染后再结合体外受精的研究报道(脂质体介导抑制素基因转染对牛卵泡细胞及胚胎发育的影响及机制研究[D]，华中农业大学博士研究生学位论文，2008年)，而对于直接转染早期胚胎或受精卵的研究未见有成功报道，相对于转染卵母细胞，我们采用的直接动物早期胚胎或受精卵转染，避免了体外受精操作，进一步简化了转基因动物制作程序，使得利用脂质体技术更加简便。
发明内容
由于目前转基因动物制备中的上述问题，本发明公开了一种生产非人哺乳类转基因动物的方法。本发明的技术方案如下一种生产非人哺乳类转基因动物的方法，包括构建含有目标基因的表达质粒载体和将含有目标基因的转基因胚胎移植入受体目的动物体内的步骤，所述目标基因为各种非编码蛋白的功能基因和蛋白质编码基因，其中，所述含有目标基因的表达质粒载体的上游包含真核启动子及其基因表达调控元件序列；在上述步骤中间还含有目标基因的转基因胚胎的培育步骤，所述培育步骤包括以下步骤将构建所得的含有目标基因的表达质粒载体与阳离子脂质体混合，室温下，混勻孵育，得到含有目标基因的阳离子脂质体复合物；将步骤(1)所得的含有目标基因的阳离子脂质体复合物直接转染非人哺乳动物早期胚胎或受精卵中，37°c，5% CO2条件下共培养4-6小时，筛选报告基因标记，采用分子生物学技术进行检测，得到含有目标基因的转基因胚胎。
上述技术方案中所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其中，所述目标基因为GFP基因。上述技术方案中所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其中，步骤O)中阳离子脂质体复合体直接转染非人哺乳动物的1-8细胞的胚胎；作为本技术方案的优选方案，步骤(1)中含有目标基因的表达质粒与阳离子脂质体之间按照(1-3) yg IyL的比例进行混合。上述技术方案中所述的所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其中，步骤(1)中含有目标基因的表达质粒与阳离子脂质体之间按照(1-3) μ g Iy L的比例进行混合。上述技术方案中所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其中，所述受体目的动物为小鼠、猪、羊、牛或兔。上述技术方案中所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其中，所述非人哺乳类转基因动物为用于基因的功能确证、动物疾病模型建立、转基因药物生物反应器生产以及具有不同功能的生产特性转基因动物。上述技术方案中所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其中，步骤O)中的采用分子生物学技术进行检测是指采用常规分子方法提取转基因动物组织基因组DNA，采用PCR技术检测目标基因；采用常规Southern blotting法检测目标基因组在转基因动物染色体中的整合；Western Blotting法检测目标基因在转基因动物组织中的表达。上述技术方案中所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法在制备用于基因的功能确证、动物疾病模型建立、转基因药物生物反应器生产以及具有不同功能的生产特性转基因动物中的应用。本发明具有以下有益效果1、本发明的技术是以阳离子脂质体与含有目标基因的表达质粒载体共孵育，再导入动物早期胚胎或受精卵，该方法简便、高效，而且操作过程中质粒等中间产物稳定，能获得性状稳定的转基因动物；2、本发明采用的直接动物早期胚胎或受精卵转染，与目前现有技术使用的转染卵母细胞技术相比，避免了体外受精操作，进一步简化了转基因动物制作程序，使得利用脂质体技术更加简便；3、采用本发明的方法制备的转基因小鼠、猪、羊、兔的整合阳性率可达30%以上，远高于传统的显微注射法，成本和制作复杂程度远低于核移植技术方法制作转基因大动物。
1、图1为本发明中所用表达载体p3GFP(包含目标基因GFP)图谱。2、图2为转基因小鼠阳性胚胎荧光激发下和普通显微镜下图。3、图3为本发明转基因动物小鼠组织DNA检测结果图谱。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
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实施例1 首先以构建好含有目标基因的质粒载体p3GFP (构建方法见Han etal. 2007,High-level expression of human lactoferrin in the milk of goats byusing replication-defective adenoviral vectors, Protein Expression andPurification53(l) :225-231)如图1所示，其中包含目标基因绿色荧光蛋白(GFP)基因，进行转基因胚胎及转基因动物制作。具体步骤如下(1)目标基因载体的构建和扩增按照常规分子克隆方法，构建所需表达质粒载体，包含有目标基因GFP，上游包含真核启动子及其基因表达调控元件序列。(2)阳离子脂质体复合物与表达载体共孵育首先向1. 5mL Eppendorf管中加入500 μ L DMEM，再加入1 μ L脂质体(Lipofectamine2000, Invitrogen)，混合均勻，记做 A 液；再次向1. 5ml Eppendorf管中加入500 μ L DMEM,再加入1-3 μ g线性化的表达载体，混合均勻，记做B液；最后，将A液与B液在室温下放置5min，集中到一个Eppendorf管中，记做C液，室温静置10-20min。(3)胚胎的获得脂质体转染。小鼠自然交配后12 48h，获得原核胚和8细胞以前的胚胎；具体小鼠为6-7周龄的雌性小鼠，PMSG超排，8IU/只，48小时后注射hCG，合笼交配，12-48小时后短颈处死，获得原核胚胎，去除颗粒细胞后，将原核胚转移在含有0. 3%的Pronase E的M199液滴中消化lOmin，再转移在含有添加10% FCS液滴中阻止消化。应用M199洗涤2-3次，然后转移在含有脂质体的转染液中进行转染。猪卵母细胞来自河北昌黎屠宰场，体外成熟培养后，以猪鲜精(河北昌黎种猪场)进行体外受精，受精处理1 池；牛卵母细胞来自地方屠宰场，体外卵母细胞培养成熟，经体外受精；羊来自地方农家，饲养后激素处理超数排卵，自然交配后活体采胚，获得原核胚。兔来自河北昌黎牛头崖地方农户，饲养后激素处理超数排卵，动物自然交配后手术法获得原核胚胎；(4) DNA载体与胚胎共孵育将上述脂质体DNA复合物转染早期胚胎或受精卵(猪、牛、羊、兔)，37°C，5% CO2条件下共培养4_6h，更换完全营养培养基(胚胎专用培养基)，24-48h继续培养后，倒置荧光显微镜观察，筛选获得目标基因转录与表达的阳性转基因胚胎如图2所示，图2中左侧为普通光下转基因小鼠胚胎，右侧为荧光激发下转基因小鼠胚胎。(5)转基因动物的检测与鉴定常规分子方法提取转基因动物组织基因组DNA，PCR检测目标基因GFP，所用引物为 5' -tGACATGAAACTTGTCTTCC-3‘ ,reverse 5' -cTTACTTCCTGAGGAATTC-3‘。结果见图3，图中，泳道 M 为 DNA Marker，分子片段大小依次为 250bp、500bp、750bp、lOOObp、1500bp、2000bp、和3000bp ； 1-6为转基因动物组织样品；7为空白对照；8为阴性对照，以不含目标基因的质粒为模板；9为质粒载体为阳性对照。小鼠基因组DNA提取。(1)切取Icm左右的新生小鼠尾部放于1. 5ml离心管，添加 0.5ml 消化溶液(50mM Tris, pH 8. 0, IOOmM EDTA,0. 5% SDS)和蛋白酶 K 25 μ 1 (lOmg/ml), 55度水浴。(2)添加0. 5ml饱和酚到消化后的离心管中，振摇2min ； (3) 10000rpm/min离心5min，取上清水溶液移至新管，弃去有机溶剂层；(4)再以0. 5ml苯酚-氯仿抽提1次，10000rpm/min离心5min，小心取上清水溶液到新离心管；(5)添加50 μ 13Μ醋酸钠(ρΗ6. 0)和0. 5ml无水乙醇，轻轻混勻，10000rpm/min离心lmin，弃去上清液，获得DNA沉淀，以70%乙醇清洗1次，离心弃去酒精，以TE(10mM Tris, ρΗ 8. 0，ImMEDTA)或dH20溶解基因组DNA。常规Southern blotting法检测目标基因组在动物(鼠、猪、牛、羊、兔)染色体中的整合，Western Blotting法检测目标基因在转基因动物组织中的表达。所用一抗为兔(鼠)抗目标蛋白(如GFP)单克隆抗体，二抗为HRP辣根过氧化酶标记抗兔(鼠)IG,目标蛋白(如GFP)标准品为进口或国产。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
权利要求
1.一种生产非人哺乳类转基因动物的方法，包括构建含有目标基因的表达质粒载体和将含有目标基因的转基因胚胎移植入受体目的动物体内的步骤，所述目标基因为各种非编码蛋白的功能基因和蛋白质编码基因，其特征在于，所述含有目标基因的表达质粒载体的上游包含真核启动子及其基因表达调控元件序列；在上述步骤中间还含有目标基因的转基因胚胎的培育步骤，所述培育步骤包括以下步骤(1)将构建所得的含有目标基因的表达质粒载体与阳离子脂质体混合，室温下，混勻孵育，得到含有目标基因的阳离子脂质体复合物；(2)将步骤(1)所得的含有目标基因的阳离子脂质体复合物直接转染非人哺乳动物早期胚胎或受精卵中，37°C，5% CO2条件下共培养4-6小时，筛选报告基因标记，采用分子生物学技术进行检测，得到含有目标基因的转基因胚胎。
2.根据权利要求1所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于所述目标基因为GFP基因。
3.根据权利要求1或2所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于步骤(2)中阳离子脂质体复合体直接转染非人哺乳动物的1-8细胞的胚胎。
4.根据权利要求3所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于步骤(1)中含有目标基因的表达质粒与阳离子脂质体之间按照(1-3) μ g Iy L的比例进行混合。
5.根据权利要求1或2所述的所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于步骤⑴中含有目标基因的表达质粒与阳离子脂质体之间按照(1-3) y g IyL的比例进行混合。
6.根据权利要求1或2所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于所述受体目的动物为小鼠、猪、羊、牛或兔。
7.根据权利要求1或2所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于所述非人哺乳类转基因动物为用于基因的功能确证、动物疾病模型建立、转基因药物生物反应器生产以及具有不同功能的生产特性转基因动物。
8.根据权利要求1或2所述的生产非人哺乳类转基因动物的方法，其特征在于步骤(2)中的采用分子生物学技术进行检测是指采用常规分子方法提取转基因动物组织基因组DNA，采用PCR技术检测目标基因；采用常规Southern blotting法检测目标基因组在转基因动物染色体中的整合；采用常规Western Blotting法检测目标基因在转基因动物组织中的表达。
全文摘要
本发明一种生产非人哺乳类转基因动物的方法，包括(1)构建含有目标基因GFP的表达质粒载体。(2)含有目标基因GFP的阳离子脂质体复合物的制备。(3)含有目标基因GFP的阳离子脂质体复合物直接转染非人哺乳动物早期胚胎或受精卵中，得到含有目标基因GFP的转基因胚胎。(4)将含有目标基因的转基因胚胎移植入受体动物体内。本发明的技术是以阳离子脂质体与含有目标基因GFP的表达质粒载体共孵育，再导入动物早期胚胎或受精卵，该方法简便、高效，而且操作过程中质粒等中间产物稳定，能获得性状稳定的转基因动物。
文档编号C12N5/10GK102559756SQ20111045709
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者李青旺, 胡建宏, 赵红卫, 韩增胜 申请人:西北农林科技大学