专利名称：一种酯酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种酯酶及其制备方法和应用。
技术背景
数量巨大的不可培养的微生物中蕴藏着丰富的资源优势，宏基因组的研究为挖掘这一资源优势提供了可靠的技术保障。95%的海洋微生物在现有的实验条件下无法或很难实现人工培养，直接从环境中提取DNA，建立理论上可以覆盖环境中所有微生物的遗传信息宏基因组文库。在海洋深度100米以上的极端环境中获得的基因片段，将这些基因异源表达，有可能得到具有应用价值的新基因。通过构建海洋底泥宏基因组文库，保存海洋微生物的基因多样性，以利于不同类型新型基因的研究与开发利用。
脂肪酶和酯酶是重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应， 广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的规模化生产对于酶催化合成多种化学品有重要意义。
本发明拟从海洋底泥宏基因组文库中筛选抗逆性强，性质优良的新型酯酶和脂肪酶基因，为酶法催化生产化工产品提供备选资源。
发明人在前期的工作中，成功构建了我国南海0 100米深底泥宏基因组文库，该库容DNA达194MB，经酶切、连接和转化，共获得118,000个含有外源基因片段的重组子，其外源片段长度在1.0-8. OKb之间。建立了酯酶的筛选模型。通过功能筛选获得一个具有酯解活性的插入片段。该片段全长3，48^p，GenBank注册号为GQ168545. 1。经ORF Finder 预测，该片段有2段完整的ORF序列。其中，编码酯酶或脂肪酶基因的est_p6位于插入片段的2,0 3，lOlbp。该基因全长l，074bp，编码357aa。其在GenBank的注册号为 ACZ16565. 1。将该序列在GenBank中进行同源搜索，发现与之相似性最高的蛋白是来源于未培养的海洋细菌的脂解酶(其在GenBank的注册号为ADA70(^8. 2)，相似性为73%。结构预测结果显示，Est_p6具有完整的α/β水解折叠保守结构域(PRK10162)，该结构域包含了丝氨酸、谷氨酸和组氨酸组成的催化三联体，构成酯酶/脂肪酶的催化中心，归属于酯酶/脂肪酶超级家族(C112031)。综上所述，Est_p6应为酯酶/脂肪酶超级家族(cll2031) 一名新成员。
SignalP分析，Est_p6的Ist到^th氨基酸是N端信号肽，26th和27th之间为切割位点(AVA26-(TE)。发明内容
本发明的目的是提供一种新型酯酶。
本发明的另一目的是提供该酯酶的制备方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供的一种酯酶ht_p6_，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
编码上述酯酶的基因，优选为est_p6_，所述est_p6_基因是去掉了 N端的前78个编码信号肽的碱基的est_p6基因，所述est_p6基因在GenBank中的登录号为ACZ16565. 1。
制备上述基因的载体，优选为pET28a-eSt_p6_，该载体含有est_p6_基因。
上述表达载体pET28a-eSt_p6_，由下述方法构建而得
(1)以宏基因组文库中含有est_p6基因插入片段的质粒为模板，PCR扩增出去掉信号肽的酯酶基因est_p6_ ；
(2)将步骤(1)的扩增产物经测序验证后，与pET28a载体重组，得到重组大肠杆菌表达载体 pET28a-est_p6\
步骤(1)中的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No 2所示。
将est_p6-克隆到表达载体pET28a并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到pET28a_est_ P67BL21重组表达体系。摇瓶培养并诱导表达ht_p6_，经纯化后获得ht_p6_，SDS-PAGE 表明其表观分子量为37. 5kD，与预测值相符；通过酯酶活力测定表明Est_p6_能够特异地打断化合物PNP- 丁酸酯的酯键；通过对ht_p6_的最适反应pH测定表明，其最适反应pH 值约为pH8. 60，偏碱性；通过对的最适反应温度测定表明，其最适反应温度约为 50. 0°C。酶的动力学常数测定表明，Est_p6_的最适底物为pNP-丁酸酯，对于酰基碳链较短酯类的水解活力优于长链酯类。
应当理解，本发明提供一种含有含有所述载体的宿主细胞。
更进一步，本发明还提供了一种表达酯酶的方法，其包括如下步骤
1)活化取宿主的单菌落于5ml含卡那霉素50 μ g/ml的LB培养基中，于37°C、 200 250rpm 培养至 0D_ ^ 0. 5 ；
2)培养以0. 8 1. 0%接种量将菌液转接到500ml含kan 50 μ g/ml的LB培养基中，于 37°C、200 250rpm 培养至 0D_ ^ 0. 5 ；
3)诱导向菌液中添加IPTG至终浓度为0. 5mM，于21°C、200 250rpm诱导培养 12 14小时；
4)收集细胞4°C、10000g离心10 15分钟收集细胞；弃上清，每IOOml菌液用60ml 50mM的Tris-HCl缓冲液重悬细胞，洗涤两遍；细胞重悬浮于30 40ml 50mM的 Tris-HCl缓冲液中；
5)获取粗酶提取液冰浴条件下，超声波破碎细胞；细胞破壁后，以4°C、10000 15000g离心10 15分钟，收集上清即粗酶提取液。
本发明提供了上述酯酶在脂类降解及其他油脂类化合物的生物转化中的应用。
本发明还提供所述酯酶在催化解酯、酯交换或酯合成中的应用。优选的反应PH值为pH8. 60，优选反应温度为50°C。
本发明从我国海洋底泥宏基因组文库中钓出新型酯酶基因，采用高效的表达方法，使其成功表达，为酯酶家族增添了新成员。该酯酶具有优良的酶学性质，可以应用于酶法催化脂解、酯化和转酯化相关的工业生产中，将有望成为补充和取代部分化学合成产品的新生产工艺的备选者。该酶的生产，将会在酶法水解制备天然香精、废纸浆脱墨再生等工艺中显示其重要的经济和社会价值。
图1显示的是ht_p6_蛋白纯化银染图。M为Marker，FT为初始流出液，20mM为 20mmol/L咪唑初始洗脱液，50mM为50mmol/L咪唑洗脱液的第2管，第10管和第20管(10 滴/管)，80mM为80mmol/L咪唑洗脱液的第1、2、5、6和10管，IOOmM为IOOmmol/L咪唑洗脱液的第1、2和10管。
图2显示的是pH对ht_p6_活性的影响；
图3显示的是温度对酯酶Est_p6_活性的影响；
图4显示的是ht_p6_以pNP- 丁酸酯为底物动力学常数测定的双倒数曲线图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1重组大肠杆菌表达载体pET28a-eSt_p6_的构建
(1)酯酶基因est_p6_序列的获得
经SignalP分析，Est_p6的Ist到^th氨基酸是N端信号肽，为得到高表达和易纯化的酯酶，预扩增去除信号肽的eSt_p6_基因。把est_p6基因5’端编码信号肽的78个碱基去掉，即得到est_p6_基因的序列。
(2)酯酶基因eSt_p6_的扩增
根据est_p6_基因的序列以及大肠杆菌表达载体pET28a上的多克隆位点的特征， 设计合成引物
Fff 5' -CATGCCATGGAGGAACTCCCTCCGATATT-3‘
REV 5' -CCCAAGCTTCTCGAGGTGCTTGTCAAAG-3‘
下划线分别为NcoI (Fff)和HindIII (REV)的酶切位点。以宏基因组文库中含有 est_p6基因插入片段的质粒为模板，PCR扩增出去掉信号肽的酯酶基因est_p6_。
PCR反应体系
总反应体系20 μ 1。
PCR反应条件
950C，预变性 5min ；94°C，变性 30s, 57. 8°C，退火 30s, 72°C，延伸 2min,循环 30 次； 72°C，再延伸 IOmin0
PCR产物由上海英骏生物技术有限公司测序正确后用于构建表达载体。2 χ pfu mix DNA 聚合酶 Pl (lOpmol/μΙ) P2 (lOpmol/μΙ)模板 ddH2010μ1 1 μ 1 μ Ιμ 7 μ
(3) pET28a-est_p67BL21重组表达体系的获得
用NcoI和HindIII对合成的est_p6-基因和pED8a(Novagen)载体分别进行双酶切，然后用DNA连接酶将上述片段连接，最后将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)中， 在LB (含kan 50 μ g/ml)平板上培养，初步筛选阳性克隆，经酶切验证后得到pET28a-est_ P67BL21重组表达体系。
实施例2、Est_p6"蛋白的诱导表达及纯化；
本例采用Ni-agarose亲和层析纯化(pET表达系统)目的蛋白，具体步骤如下
1)诱导培养
将表达菌株接种到装有5ml LB (含kan 50 μ g/ml)的试管中，37°C、转速250rpm、 培养过夜活化。以0.4%接种量转接5ml LB (含kan 50 μ g/ml)的液体培养基再次活化， 370C，IOh。以0. 8%接种量转接IOOml含50 μ g/ml kan的LB液体培养基，37°C摇床200rpm 培养 2 3h 至 OD600 ^ 0. 5，加入 50 μ 1 lmol/L 的 IPTG (终浓度 0. 5mmol/L)，于 21°C摇床 200rpm培养14h至OD600 7. 0，即可收集细胞。
2)Est_p6_蛋白粗提液的制备
经诱导培养的培养物10000g、4°C、离心IOmin收集细胞，除尽上清，每IOOml菌液用60ml 50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH = 7. 5)洗涤两次。最后用6ml 50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液(pH = 7. 5)重悬细胞，于冰浴中用超声波破碎细胞Q40伏特，3秒超声波破壁，7秒间歇，60个循环)后，离心(15000g、4°C、10分钟)，取上清。
3)Est_p6-蛋白纯化
基于pET28a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，所以本专利选择使用 Ni-NTA Agarose (QIAGEN)亲和层系纯化蛋白，纯化ht_p6_蛋白的步骤如下
1)清洗吸取Iml Ni-NTAAgarose (QIAGEN)于SPE筛板IOml层析柱(康为世纪) 中，先用50ml去离子水清洗，再用IOOml含0. 3mol/L NaCl的IOmmol/L咪唑(pH = 8. 0) 清洗(下文中不同浓度的咪唑缓冲液均含有0. 3mol/L的NaCl，pH = 8. 0)；
2)结合用anl IOmmol/L的咪唑缓冲液转移清洗好的Ni-NTAAgarose至5ml菌保管中，加入蛋白粗提液约:3ml，于4°C冰箱内在混合器上结合1. 5h ；
3)结合了蛋白的Ni-NTAAgarose转移至层析住中，让Ni-NTAAgarose沉降至筛板上；
4)平衡IOOml浓度为lOmmol/L的咪唑缓冲液平衡层析柱，接5ml初始流出液；
5)洗脱50ml浓度为20mmol/L的咪唑缓冲液洗脱，接初始流出液2管和最后流出液1管(收集洗脱液均为10滴洗脱液/管)；
20ml浓度为50mmol/L的咪唑缓冲液洗脱，接初始流出液10管；
IOml浓度为80mmol/L的咪唑缓冲液洗脱，接初始流出液10管；
IOml浓度为lOOmmol/L的咪唑缓冲液洗脱，接初始流出液10管；
IOml浓度为250mmol/L的咪唑缓冲液洗脱，接初始流出液10管；
6)清洗先用250ml 0. 5mol/L的NaOH清洗层析住，再用去离子水清洗以除去 NaOH ；
7)保存用9ml 30%乙醇保存Ni-NTAAgarose层析住于4°C冰箱中。
将收集的洗脱液SDS-PAGE电泳，结果分别用考马斯亮蓝染色和银染检测蛋白纯度。之后将达到电泳纯的蛋白收集起来，过夜透析去除咪唑与NaCl。
实施例3酯酶酶活测定
酯酶可以特异地打断化合物pNP-脂肪酸酯的酯键，释放出相同物质的量的脂肪酸和pNP，而pNP在碱性环境下405nm处有特殊的吸收峰，通过测定一定时间内产物pNP的生成量来计算脂肪酶/酯酶的活力。
反应体系为
将缓冲液、底物溶液(pNP-丁酸酯，4-Nitrophenyl butyrate，Sigma公司)和无水乙醇在50°C水浴中保温lOmin，加入适当稀释的酶液(0. 0499mg/ml)，反应3min，测定405nm 的吸光值，对照标准曲线计算酶活。酶活单位(unit)定义为，在上述反应条件下，每分钟释放出lymol pNP的酶量为一个酶活单位。^、丫 ^ ΔρΝΡ A405 X 稀释倍数酶活力Omol/min.ml)= —- XlOO=-—— XlOO
酶活力(ymol/min‘ ml) = (7. 954 + 3 +16. 731) X 100 = 15. 847
比酶活(μ mol/min · mg) = 15. 847 + 0. 0499 = 317. 575
实施例4酶学性质分析
1) SDS-PAGE方法测定分子量
SDS-PAGE方法测定酶的亚基分子量，根据已知分子量的标准蛋白在SDS-PAGE中的相对迁移率&作图，得其分子量。结果如图2所示，Est_p6_的SDS-PAGE表观分子量约为37. 5kDa。并且SDS-PAGE电泳表明，经过Ni_agarose亲和层析纯化后的Est_pf可达到电泳纯。
幻酶的最适反应pH值
配制不同pH(50mmol/L)的缓冲液，pH分别为 2. 55、3. 71、4. 68、5. 24、5. 57、6. 16 的柠檬酸缓冲液，pH 分别为 5. 69,6. 11,6. 58,6. 83,7. 05,7. 36,7. 57,7. 82,8. 10 的 MOPS 缓冲液，PH 分别为 7. 12,7. 40,7. 60,7. 83,8. 01,8. 60,9. 10 的 Tri-HCl 缓冲液，pH 分别为 9. 11、 9. 61、10. 09的CHES缓冲液，以及pH分别为9. 78、10. 09、11. 06的CAPS缓冲液。将酶液分别加入到上述PH的缓冲液中，按标准方法测定酶活力，以酶活最高者定位100%，以相对活力和对应的PH值作图。结果表明(图3)，Est_p6_的最适pH值约为pH8. 60，偏碱性。
3)酶的最适反应温度
将底物溶液和pH8. 60、50mmol/L 的 Tri-HCl 缓冲液分别在 0°C、10°C、20°C、30°C、 35°C、40°C、45°C、47. 5°C、50°C、52. 5°C、55°C、60°C的不同温度的水浴中保温 lOmin，然后加入酶液按照标准方法测定酶活力，得到酶液在不同反应温度下具有的酶活力，以酶活最高者定为100%，以相对活力对温度作图。结果表明(图4)，酶的最适反应温度约为50°C。
权利要求
1.一种酯酶ht_p6_，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.编码权利1所述酯酶的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其为pET28a-est_p6_。
5.如权利要求4所述的表达载体，其构建方法如下(1)以宏基因组文库中含有est_p6基因插入片段的质粒为模板，PCR扩增出去掉信号肽的酯酶基因est_p6_ ；(2)将步骤(1)的扩增产物经测序验证后，与pET28a载体重组，得到重组大肠杆菌表达载体 pET28a-est_p6-。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，步骤(1)中的PCR扩增引物核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
7.含有权利要求3 6任意一项所述表达载体的宿主细胞。
8.权利要求1所述酯酶在脂类降解及其他油脂类化合物的生物转化中的应用。
9.权利要求1所述酯酶在催化解酯、酯交换或酯合成中的应用。
10.一种表达酯酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)活化取宿主的单菌落于5ml含卡那霉素50μg/ml的LB培养基中，于37°C、200 250rpm 培养至 OD600 ^ 0. 5 ；2)培养以0.8 1. 0%接种量将菌液转接到500ml含kan 50 μ g/ml的LB培养基中， 于 37°C、200 250rpm 培养至 0D_ ^ 0. 5 ；3)诱导向菌液中添加IPTG至终浓度为0.5mM，于21°C、200 250rpm诱导培养12 14小时；4)收集细胞4°C、IOOOOg离心10 15分钟收集细胞；弃上清，每IOOml菌液用60ml 50mM的Tris-HCl缓冲液重悬细胞，洗涤两遍；细胞重悬浮于30 40ml 50mM的Tris-HCl 缓冲液中；5)获取粗酶提取液冰浴条件下，超声波破碎细胞；细胞破壁后，以4°C、10000 15000g离心10 15分钟，收集上清即粗酶提取液。
全文摘要
本发明提供了一种酯酶Est_p6-，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明从我国海洋底泥宏基因组文库中钓出新型酯酶基因，采用高效的表达方法，使其成功表达，为酯酶家族增添了新成员。该酯酶具有优良的酶学性质，可以应用于酶法催化脂解、酯化和转酯化相关的工业生产中，将有望成为补充和取代部分化学合成产品的新生产工艺的备选者。该酶的生产，将会在酶法水解制备天然香精、废纸浆脱墨再生等工艺中显示其重要的经济和社会价值。
文档编号C12N15/70GK102517265SQ20111045633
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者关国华, 商萌, 彭晴, 李颖, 王旭, 王珍芳 申请人:中国农业大学