专利名称：甘蓝tt10基因家族及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea) TTlO (TRANSPARENT TESTA 10，透明种皮10 ；又称LAC15，即LACCASE 15，漆酶15)基因家族及其应用。
背景技术：
十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚。拟南芥(Arabidopsisthaliana) TTlO (AtTTIO，At5g48100)基因位于拟南芥的第 5染色体上，是通过候选基因的方法从透明种皮(TRANSPARENT TESTA, TT)突变体ttlO中鉴定出来的。ttlO种子在收获时种皮呈浅褐色，在合点区呈深褐色，在贮藏6 12个月后， 突变体的种皮逐渐恢复为野生型种皮的深褐色。与野生型种子相比，ttlO突变体种子表现为发育过程中的褐变延迟。AtTTlO基因编码漆酶15(AtLacl5)，既参与种皮中原花青素 (proanthocyanidin,PA)氧化聚合成褐色的种皮色素，也参与种皮中木质素(Iignin)单体氧化聚合成木质素。芸薹属和拟南芥同属十字花科，可能具有相同的色素位点。原花青素是形成甘蓝型油菜黑籽颜色的基础，在黄籽种皮中明显降低。木质素含量也是甘蓝型油菜的重要性状之一，在十字花科的黄籽系中明显低于在褐籽或黑籽中的含量，与十字花科的黄籽表型密切相关。因此，在芸薹属中对TTlO基因进行同源克隆和功能鉴定，将有助于揭示甘蓝型油菜种皮色素和木质素的分子机理，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700 1800万年前发生分离，芸薹族植物发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种白菜(AA组，5^Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp) 和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，则约相当于拟南芥基因组的6倍。也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前，TTlO基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性及与黄籽性状的关系等都未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TTlO
基因家族。为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TTlO基因家族成员的全长CDNA和对应的基因组序列，并对其进行了系统分析。结果显示所述白菜TTlO (BrTTlO)基因家族包括以下3个成员BrTT10_lA基因、BrTTlO-IB 基因和BrTT10-2基因；所述BrTTlO-IA基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 2所示， BrTTlO-IB基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT10-2基因的全长cDNA序列如 SEQ ID No. 6 所示；所述甘蓝TTlO (BoTTlO)基因家族包括以下2个成员=BoTTlO-I基因和 BoTTlO-Ipse 基因；所述BoTTlO-I 基因的全长 cDNA序列如 SEQ ID No. 8 所示，BoTTlO-Ipse 基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 9所示；所述甘蓝型油菜TTlO(BnTTlO)基因家族包括以下3个成员&ιΤΤ10_1基因、 ΒηΤΤ10-2基因和&1ΤΤ10-3基因；所述BnTTlO-I基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 11所示，BnTT10-2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 12所示，ΒηΤΤΙΟ-3基因的全长cDNA序列如 SEQ ID No. 14 所示。进一步，所述BrTTlO-IA基因的基因组序列如SEQ ID No. 1所示，BrTTlO-IB基因的基因组序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT10-2基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTTlO-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示；所述&ιΤΤ10_1基因的基因组序列如 SEQ ID No. 10所示，ΒηΤΤ10-3基因的基因组序列如SEQ ID No. 13所示。BrTTlO-IA基因与BrTTlO-IB基因的序列极其相似，可能互为一对等位基因。 BoTTlO-Ipse假基因与BoTTlO-I基因的序列一致，但在编码区发生2处单碱基缺失，导致提前终止突变，二者可能互为一对等位基因。根据基因序列和表达模式的分析，BnTTlO, BrTTlO和BoTTlO基因家族成员可分为两种类型BnTT10_3和BrTT10_2基因为I型基因， 它们与AtTTlO的同源性更高，可能参与原花青素聚合物的进一步氧化以及木质素的聚合反应；其它基因为II型基因，各成员之间具有较高的序列同源性，可能参与原花青素的聚合反应。生物信息学预测表明，BnTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族的正常编码蛋白序列中存在多铜氧化酶家族的3个保守结构域和4个铜离子结合基序Ll L4，与其它高等植物漆酶蛋白之间具有很高的同源性，由此预测&1TT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族编码漆酶。 TTlO基因主要在甘蓝型油菜、白菜和甘蓝发育的种子中表达，在黑、黄籽近等基因系发育阶段尤其是后期转色阶段的种子中有差异表达，不同的基因成员表现出不同的黑、黄籽差异表达模式。根据基因序列分析、组织特异性表达和在黑、黄籽近等基因系之间的表达差异， 可以推断甘蓝型油菜的foiTTlO-1、BnTT10-3基因分别来自于白菜的BrTTlO-IA和BrTT10_2 基因，而甘蓝型油菜的&1TT10-2基因则来自于甘蓝的BoTTlO-I基因。基于上述结果，利用本发明的&1TT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族中的任一种或多种基因或基因截短片段，可以构建TTlO基因重组表达载体和转化体，用于TTlO基因的正义表达、反义抑制、RNA干扰等。本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TTlO基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TTlO基因家族在甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用。为达到上述目的，本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TTlO基因家族特异保守片段BTTlOA (核苷酸序列如SEQ ID No. 11中第653 1604位碱基所示)作为反义片段，将其反义插入PCAMBIA2301G载体的CaMV35S启动子和Nos终止子之间，构建了 BnTTlO.BrTTIO和BoTTlO基因家族共抑制的反义抑制表达载体，并通过农杆菌介导的下胚轴侵染法转入3个不同的甘蓝型油菜品种，得到了抑制内源TTlO转录本效果为0 83%的转基因株系，且3个品种转基因材料的表型修饰效应一致。研究发现，在&1TT10基因家族表达受到抑制的转基因株系中，种子的着色明显晚于对照，表现为转色延迟，种皮中可溶性原花青素含量增加，而种皮木质素含量降低，证明&1TT10基因家族参与了甘蓝型油菜的种皮着色、种皮原花青素单体的聚合和种皮木质素的合成。发明人在前期研究中已发现TT12 等多个基因家族在甘蓝型油菜黄籽材料中的表达均有下调，因此推测&1TT10基因的表达下调参与了黄籽性状的形成，但它本身不是最源头上的黄籽主要位点，而是受黄籽主效基因调控的效应基因之一。&1TT10基因家族在种皮成熟转色、种皮木质素含量等种子性状的分子育种中具有应用价值，但必须对包括&1TT10在内的多个位点同时进行操作。本发明的有益效果在于本发明提供了 TTlO基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性等，并确认了 TTlO基因参与了种皮着色、种皮原花青素单体的聚合和种皮木质素的合成，为受黄籽主效基因调控的效应基因之一，由此本发明提供了 TTlO基因在芸薹属作物种皮成熟转色、种皮木质素含量等种子性状的分子育种特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种中的应用，应用前景好。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为甘蓝型油菜、白菜和甘蓝第一链cDNA的获得，其中M为DNA marker, A、B、 C分别为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝。图2为&1TT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族成员全长cDNA的扩增，其中a、b、c分别为甘蓝型油菜、白菜和甘蓝M为DNA marker, 1 9为分别采用9种引物组合扩增所得 PCR 产物，d 为 BrTT10-2 和 &ιΤΤ10_3 基因全长 cDNA。
图3为&1TT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族成员的Southern杂交鉴定。图4为&1TT10、BrTTlO和BoTTlO家族蛋白及AtTTlO蛋白的氨基酸序列比对。图5为&1TT10、BrTTlO和BoTTlO家族蛋白与其它植物漆酶的系统进化树，其中 ApLACl 为山槭漆酶 1 (AAB09228)，AfLAC 为黄曲霉漆酶(XP_002378028)，AtTTlO 为拟南芥 TT10(NP_199621)，AtLAC 12 为拟南芥漆酶 12 (NP_196158)，AtLAC 13 为拟南芥漆酶 13(NP_196330)，AtLAC 14 为拟南芥漆酶 14(NP_196498)，CmLAC 为板栗漆酶(ACI46953)， 0sLAC2为水稻漆酶2 (Q8RYM9)，0sLAC9为水稻漆酶9 (Q6Z8L2)，PtLACl为火炬松 (AAK37823)，PtLAC2 为火炬松(AAK37824)，RcLAC 为蓖麻(XP_002527130), SlAOX 为番茄抗坏血酸氧化酶(AAY47050)，ZmLAC3为玉米漆酶3 (NPJ)Ol 105915)；进化树分支上的数字表示靴值检验的百分率(1000次重复)。图6为RT-PCR检测&iTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族总体和各成员在不同组织
器官中的表达。图7为RT-PCR检测&iTT10、BrTTlO和BoTTlO基因家族总体和各成员在黑、黄籽
近等基因系生殖器官中的表达。图8为&iTT10、BrTT10和BoTTlO基因家族反义抑制表达载体ρΒΤΤΙΟΑ的元件图。图9为转基因甘蓝型油菜植株的PCR鉴定，其中a为转基因ffestar，b为转基因中油821，c为转基因中双10号；上排扩增引物为FGUS+RGUS，下排扩增引物为 F35S3N+FTT10A。图10为转基因和对照甘蓝型油菜种子中&1TT10基因家族及各成员的表达量检测，其中a为T2代转基因和对照Westar种子中&ιΤΤ10基因的总体表达，b为T2代转基因和对照中油821种子中&1TT10基因的总体表达，c为T2代转基因和对照中双10号种子中 BnTTlO基因的总体表达，d为T2代转基因和对照Wfestar种子中&ιΤΤ10基因家族各成员的表达。图11为转基因和对照甘蓝型油菜种子的转色过程，其中a为转基因和对照(CK) 中油821种子，b为转基因和对照(CK)中双10号种子。图12为转基因和对照ffestar T3种皮的可溶性原花青素含量(a)和不可溶性原花青素含量(b)，其中V-10、V-12、V-13为转基因阳性株系，BnTTlO基因表达受到抑制；V-22 为转基因阳性株系，但&1TT10基因表达未收到抑制；V-24为对照株系，BnTTlO基因表达正常汀2寸为T2代转基因阳性株系J2-CST1代转基因阳性株系的T2代分离阴性株或反义片段丢失的株系。图13为转基因和对照Wfestar种皮的可溶性木质素含量，其中V-10、V-12、V-13、 V-22、V-24、T2-P 和 T2-C 的含义同图 12。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例采用的植物材料白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp. oleifera)，包括典型黑籽品系06K130以及黄、黑籽近等基因系09L597 (黑籽)和09L600 (黄籽)；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种(B. oleracea var. acephala)，包括典型黑籽品系06K158以及黄、黑籽近等基因系09甘1 (黑籽)和09甘4 (黄籽)；甘蓝型油菜材料包括典型黑籽保持系5B以及黄、黑籽近等基因系09L588 (黑籽)和09L587 (黄籽)，均由重庆市油菜工程技术研究中心提供，大田常规种植；甘蓝型油菜黑籽模式材料Westar和黑籽商业品种中油821DH系由重庆市油菜工程技术研究中心提供，黑籽双低商业品种中双 10号由中国农业科学院油料作物研究所提供。优选实施例采用的主要试剂及试剂盒Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Easy-Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)、DL-2000 plus Marker、 PEASY-T3载体购自北京全式金生物技术有限公司；DNA分子量标准DL-2000、λ -HindIII digest DNA Marker.rTaq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶(5U/μ 1)和 Ex Taq Hot Start DNA 聚合酶(5U/ μ 1)、pMD18-T 和 pMD19_T 载体、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV、SacI(10U/y 1)购自美国New England Biolabs 公司；限制性内切酶 BamHI 和 SacI(10U/μ 1)、T4 DNA 连接酶(lOU/μ 1) 购自立陶宛 MBI Fermentas 公司；MS (Murashige & Skoog medium, including vitamins) 基本培养基购自荷兰Duchefa Biochemie公司；pGEM_T easy载体购自Promega公司；柱式小量植物组织RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit购自美国hvitrogen公司，Southern杂交试剂、检测试剂盒、尼龙膜、地高辛标记的DNA Marker购自德国Roche公司。优选实施例采用的主要仪器PTC-200Programmable Thermal Controller PCR 仪购自美国MJ Research公司，Veriti 多重控温PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；UVP HL-2000杂交紫外交链仪购自美国UVP公司，Bio-Rad Model 785真空转膜仪购自美国Bio-Rad公司，以及分子生物学和基因工程的其它常规仪器和设备。—、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TTlO基因家族的克隆1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1. 2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的231Λ条带，RNA消化比较完全，经分光光度法检测纯度较高，可以直接用于PCR扩增及Southern杂交。2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝各器官总RNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的蕾(Bu)、 花(Fl)、开花后10天的种子(IOD)、开花后20天的种子(20D)和开花后30天的种子(30D)； 以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜09L587和09L588、白菜09L600和09L597、甘蓝09 甘4和09甘1的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St), Bf (Le)、蕾、花、荚果皮(SP)以及发育不同阶段的种子(甘蓝型油菜和甘蓝取15D、30D、45D和55D的种子；白菜取10D、 25D、40D和45D的种子)共12个器官；采用柱式小量植物总RNA抽提试剂盒提取各器官总 RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1. 2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，获得的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。
3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝RACE第一链cDNA的获得分别取甘蓝型油菜5B、白菜06K130和甘蓝06K158的蕾、花和3个发育时期的种子的总RNA混合成总量为5 μ g的RNA样品，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的 RACE操作，最终反转录获得在3’端和5’端同时锚定有人工接头序列的第一链cDNA，PCR 放大后进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，三个物种的总cDNA呈现出大小在200bp 101Λ的拖带，重心区域在11Λ 41Λ，说明反转录比较完全，得到了较高质量的 cDNA,可用于克隆甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TTlO基因家族完整的cDNA末端。4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TTlO基因家族5’ cDNA末端的克隆通过Vector NTI Advance 9. 0 对 AtTT10/AtLacl5 基因以及其它 16 个漆酶 (AtLacI-AtLac 14、AtLacl6和AtLacl7)基因序列进行多重比对，选取AtTTlO基因与其它拟南芥漆酶成员核酸序列中的差异位点设计了 2条正向引物(FTT10-31和FTT10-32)和2 条反向引物(RTT10-51和RTT10-52)(表1)作为扩增甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TTlO基因家族成员cDNA末端的基因特异引物(GSP)。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，用引物组合5，P+RTT10-51进行 5，cDNA 末端的 RACE—扩。50 μ 1 标准 Taq PCR 扩增体系为10 X PCR Buffer 5μ 1, 25mmol/L 的 MgCl23 μ 1,10mmol/L 的 dNTPs 1 μ l,10ymol/L 的正向引物 1 μ l,10ymol/L 的反向引物1 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加双蒸水至总体积为50 μ 1。PCR 扩增程序为94°C预变性2分钟；再94°C变性1分钟，52°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共 25个循环；最后72°C延伸10分钟。表15’和3’ RACE中的基因特异引物和GeneRacer试剂盒引物
引物名称引物序列(5’-3')GeneRacer 5'PcgactggagcacgaggacactgaGeneRacer 5'NPggacactgacatggactgaaggagtaGeneRacer 3'PgctgtcaacgatacgctacgtaacgGeneRacer 3’ NPcgctacgtaacggcatgacagtgRTT10-51ctatgcgcgtgccaccaaacagtRTT10-52tgccaccaaacagtcgtgtcttcFTT10-31cctatgcatctccatggttttagcttFTT10-32ttctatgtggttggagtagggttcgg 以一扩产物为模板，用引物组合5，NP+RTT10-52进行5，cDNA末端的RACE巢扩， PCR扩增体系与一扩相同但模板改为0. 1 μ 1，PCR扩增程序为94°C预变性2分钟；再94°C 变性1分钟，43 48°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与T 载体(pMD18-T或pMD19-T)连接，再转化大肠杆菌(DH5 α或JM109)感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培养至蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp 的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR鉴定，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，每个物种挑选8 9个代表性单克隆子委托上海英竣生物工程技术有限公司进行测序。测序结果表明&ιΤΤ10基因家族得到长度分别为405 (2种序列)、409、374和379bp [均不包括poly (A)，下同]的5个5，cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明它们与AtTTlO基因 (NM_124184)具有很高的同源性，可能分别代表2种不同的5，cDNA末端；BrTTlO基因家族得到长度分别为346、357、374、379、405 (2种序列)、406和409bp的8个5，cDNA末端，表现为差异明显的两种类型，但都与AtTTlO基因具有较高的同源性；BoTTlO基因家族得到长度分别为379(2种序列)、398、405、409和411bp的6个5，cDNA末端，均与AtTTlO基因有较高的同源性，可能代表2种不同的5’ cDNA末端。5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TTlO基因家族3，cDNA末端的克隆分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用引物组合3，P+FTT10-31进行3，cDNA末端的RACE —扩。PCR扩增体系和程序与5，cDNA末端的RACE —扩相同。以一扩产物为模板，用引物组合3，NP+FTT10-32进行3，cDNA末端的RACE巢扩， PCR扩增体系和程序与5’cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物如前法所述进行电泳检测、 胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。测序结果表明&ιΤΤ10基因家族得到长度分别为430 (4个)、407和387bp的6个3，cDNA末端，NCBI BLASTn分析表明这些3’cDNA末端与AtTTlO基因具有很高的一致性，表明它们的确为&1TT10基因家族的3’ cDNA末端，但这些不同长度的片段序列一致，可能代表同一种 3’ cDNA末端，片段长度差异是由可变poly (A)加尾位点所引起；BrTTlO基因家族得到长度分别为448 (2个)、449 O个)、403、390和377bp的7个3，cDNA末端，这些3，cDNA末端与 AtTTlO基因具有很高的一致性，可能代表2种3，cDNA末端；BoTTlO基因家族得到长度分别为430、430、388和390bp的4个3，cDNA末端，均与AtTTlO基因一致性较高，可能代表2 种3，cDNA末端。6、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TTlO基因家族成员全长cDNA的克隆根据所获得的&1TT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族5，和3，cDNA末端序列，设计了 3 条正向引物(FBNTT10、FBRTT10、FBOTT10)和 3 条反向引物(RBNTT10、RBRTT10、RBOTT10) (表幻，将所有正向引物与反向引物两两配对，形成9种引物组合。分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝第一链cDNA为模板，采用上述引物组合和50 μ 1标准Taq PCR扩增体系，扩增甘蓝型油菜、白菜、甘蓝TTlO基因家族各成员的全长cDNA ；PCR扩增程序为94°C预变性2分钟，再94°C变性1分钟、57°C退火1分钟、72°C延伸2分钟，共35个循环，最后72°C延伸10 分钟；PCR产物如前法所述进行电泳检测(图幻、胶回收、T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测序。结果分别得到&1TT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族的3条、3条和8条全长cDNA序列，合并相同的基因序列，并设计特异检测引物，经过筛选、验证及补充克隆后，将不同的独立基因(imigenes)分别命名为&ιΤΤ10-1、ΒηΤΤ10-2、 BrTT10-lA、BrTT10_lB、BoTTlO-I 和 BoTT10_lpse。经过分析和比对，发现 BrTTlO 基因家族获得的一个5’ cDNA末端没有扩增获得相应的3’ cDNA末端和全长cDNA序列，针对该末端设计实验方案以白菜第一链cDNA为模板，以该5，cDNA末端的对应引物FBRTT10 与GeneRacer 3，NP配对，用Ex Taq Hot Start进行扩增，获得相应的全长cDNA，命名为BrTT10-2 ；再设计相应的3，cDNA末端引物RBRTT10-I与FBRTT10配对，扩增BnTTlO, BoTTlO基因家族的相应cDNA，获得&1TT10-3，而甘蓝中没有获得相应基因。由于BrTT10_2、 &1TT10-3的基因序列与AtTTlO基因序列具有更高的同源性，因此将此类基因定义为I型基因，其它基因则定义为II型基因。多重序列比对的分析结果表明这些基因的全长cDNA序列与AtTTlO基因有很高的同源性，且都存在与它们对应的3’和5’ RACE末端。表2BnTT10、BrTTlO, BoTTlO基因家族成员全长cDNA和基因组序列扩增引物
权利要求
1.甘蓝TTlO基因家族，其特征在于包括以下2个成员=BoTTlO-I基因和BoTTlO-Ipse 假基因；所述BoTTlO-I基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTTlO-Ipse假基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 9所示。
2.根据权利要求1所述的甘蓝TTlO基因家族，其特征在于所述BoTTlO-I基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示。
3.含有权利要求1或2所述的甘蓝TTlO基因家族中任一种或多种基因或基因保守片段的重组表达载体。
4.权利要求1或2所述的甘蓝TTlO基因家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用，所述种子性状为种皮成熟转色和种皮木质素含量。
全文摘要
本发明公开了甘蓝TT10基因家族，包括BoTT10-1基因(SEQ ID No.7～8)和BoTT10-1pse假基因(SEQ ID No.9)；该基因家族可应用于芸薹属作物种子性状的分子育种。
文档编号C12N15/63GK102492695SQ201110459818
公开日2012年6月13日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者卢坤, 张凯, 曲存民, 李加纳, 柴友荣, 梁颖, 王敬乔, 王瑞, 陈薇 申请人:西南大学