专利名称：具有二萜合酶活性的多肽的制作方法
技术领域：
本申请特别地涉及具有二萜合酶活性的新多肽、编码所述多肽的核酸分子，以及源自Clitopilus passeckerianus的基因簇,此基因簇被认为参与生产二職，更准确地截短侧耳素的生物合成途径。
背景技术：
萜烯类和类萜类都是多种多样并且非常大的类的通常天然存在的有机化学物，它们源自五碳异戊二烯单位，所述异戊二烯单位被组装然后以多种方式修饰。萜烯类和类萜类都可在其碳骨架和官能团上彼此不同。大部分萜烯类和类萜类包含一个或多个环状结构。类萜类通常也称为类异戊二烯类。可根据其骨架的部分的萜烯单位(C5)的数量对萜烯类和类萜类分类。因此，单萜类由两个异戊二烯单位组成(C10，10个碳原子的骨架)，倍半萜烯类由三个异戊二烯单位组成(C15，15个碳原子的骨架)，二萜类由四个异戊二烯单 位组成(C20，20个碳原子的骨架)，诸如此类。二萜类和类二萜类通常源自栊牛儿基栊牛儿焦磷酸(GGPP)。二萜合酶是本领域技术人员熟知的酶，它通常催化使用栊牛儿基栊牛儿焦磷酸(GGPP)作为底物来分别形成二萜或类二萜的反应。在此，GGPP通常被转化为包含一个或多个碳环的环状化合物。因此，二萜合酶通常称为二萜环化酶。二萜合酶通常参与生产二萜或类二萜的生物合成途径。基因簇通常被认为是构成功能单位(例如通过编码参与一个特别的生物合成途径的多肽(如生产次级代谢物的途径的多肽))的相邻基因的组。次级代谢物是通常由某生物在特定条件下生产的物质。与初级代谢物相反，它们对于生产它们的生物通常不是必要的。光谱抗生素截短侧耳素是类萜，更准确地类二萜，是真菌次级代谢物的一个实例。它于 1951 年从 Pleurotus mutilus (Fr.) Sacc.和 Pleurotuspasseckerianus Pil 首次被分离。首先，截短侧耳素抑制革兰氏阳性细菌和支原体的生长。截短侧耳素与核糖体50S亚基的肽基转移酶组分结合并抑制细菌中蛋白质合成。截短侧耳素只是截短侧耳素抗生素类组的一个成员，该组还包含多种半合成衍生物，包括已说明在治疗猪痢疾和肺炎中有效的硫姆林、伐奈莫林和瑞他莫林(参见Yao, 2007),硫姆林(2)O I 伐奈莫林(3)f'
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权利要求
1.分离的多肽， 该多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含 与SEQ ID NO : I具有至少50%序列同一性的序列， 与SEQ ID NO :2具有至少40%序列同一性的序列，和 至少I个选自以下的序列 i)与SEQID NO 7具有至少15%序列同一性的序列； ii)与SEQID NO 4具有至少25%序列同一性的序列； iii)与SEQID NO 5具有至少45%序列同一性的序列；和 iv)与SEQID NO :6具有至少45%序列同一性的序列， 其中SEQ ID NO : 1-2和4-7源自Clitopiluspasseckerianus,并且其中所述多妝是二萜合酶。
2.根据权利要求I的分离的多肽，其中所述氨基酸序列还包含与SEQIDNO 3具有至少 50%序列同一性的序列，其中 SEQ ID N0:3 源自 Clitopilus passeckerian us。
3.根据权利要求I和2中任一项的分离的多肽，其中多肽的分子量在90kDa和140kDa之间，特别地在IOOkDa和130kDa之间，特别地在105kDa和120kDa之间； 和/或 其中多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ IDNO 9具有至少70%的序列同一性，更优选地与SEQ ID NO :9具有至少80%，甚至更优选地至少85%，或甚至至少90%，例如甚至更优选地至少95%的序列同一性的序列。
4.根据权利要求I至3中任一项的分离的多肽，其中所述多肽能催化栊牛儿基栊牛儿焦磷酸转化为截短侧耳素前体，特别地转化为根据式(I)的化合物。
5.分离的核酸分子，其包含 A)编码根据权利要求I至4中任一项的多肽或SEQID NO 9的多肽的核苷酸序列， B)核苷酸序列，所述核苷酸序列是 a)SEQ ID NO 8的序列；或 a，)SEQ ID NO :15的序列或与其互补的序列；或 b)a’)中限定的序列的部分序列，所述部分序列编码二萜合酶；或 c)编码二萜合酶并与a’)中限定的序列具有至少40%的序列同一性，或与a)中限定的序列或b)中限定的部分序列具有至少60%的序列同一性的序列；或 d)编码二萜合酶并由于a)、a’)、b)和c)中任一项限定的序列的遗传编码导致退化的序列；或 e)编码二萜合酶并能与SEQID N0:8和/或SEQ ID NO :13在严格条件下杂交的序列， C)如项B中限定的核苷酸序列的至少18个连续核苷酸， 和/或 D)至少18个连续核苷酸并且能与具有如项A或项B中限定的核苷酸序列的核酸分子在严格条件下杂交。
6.根据权利要求I至4中任一项的分离的多肽或根据权利要求5的分离的核酸分子，其中所述多肽或核酸分子能够源自真菌宿主，特别是来自担子菌门(basidomycota),更特别地来自伞菌目(agaricales),甚至更特别地来自粉裙菌科(entolomataceae)_的真菌，特别地其中所述多肽或核酸分子能够源自Clitopilus pinsitus或Clitopiluspasseckerian us。
7.包含如权利要求5A或5B中限定的核酸序列的载体。
8.选自细胞、组织和非人生物的非天然存在的宿主，所述宿主包含至少一个含有如权利要求5A或5B中限定的核苷酸序列的核酸分子和/或根据权利要求7的载体， 特别地，其中所述宿主是真菌宿主，更特别地是来自担子菌门，更特别地来自伞菌目，更特别地来自粉褶菌科的真菌。
9.生产根据权利要求I至4中任一项的多肽的方法，所述方法包括 (i)将至少一个根据权利要求5A或5B的核酸分子和/或至少一个根据权利要求7的载体引入选自细胞、组织和非人生物的宿主，和( )在适于生产多肽的条件下培养宿主， 特别地其中该方法还包括步骤(iii)从宿主回收多肽。
10.生产截短侧耳素的方法，该方法包括 (i)将根据权利要求5Ba ‘的核酸分子和/或包含根据权利要求5Ba’的核酸分子的载体引入选自细胞、组织和非人生物的宿主，和 ( )在适于生产截短侧耳素的条件下培养宿主。
11.改变选自细胞、组织和非人生物的宿主中截短侧耳素生产的方法，其中所述宿主能生产截短侧耳素并且包含至少一个含有如权利要求5A或5B中限定的核苷酸序列的核酸分子，所述方法包括操纵所述至少一个核酸分子的i)表达、ii)身份或iii)表达和身份。
特别地其中所述方法是 a)增加截短侧耳素生产的方法，或 b)减少截短侧耳素生产的方法，特别地包括破坏或下调所述至少一个核酸分子； 特别地，其中所述宿主是真菌宿主，更特别地是来自担子菌门，甚至更特别地来自伞菌目，甚至更特别地来自粉褶菌科的真菌。
12.根据权利要求5A或5B的分尚的核酸分子 a)在生产截短侧耳素中的用途，其中所述核酸分子序列的2至50个核苷酸与由能生产截短侧耳素的野生型生物包含的参与生产截短侧耳素的生物合成途径的基因簇的序列不同；或 b)在生产截短侧耳素前体中的用途，其中所述核酸分子序列的2至50个核苷酸与由能生产截短侧耳素的野生型生物包含的参与生产截短侧耳素的生物合成途径的基因簇的序列不同，特别地其中所述截短侧耳素前体是根据式(I)的化合物。
13.根据权利要求8的宿主在生产截短侧耳素或截短侧耳素前体中的用途，特别地其中所述截短侧耳素前体是根据式(I)的化合物。
14.根据权利要求5的分离的核酸用于鉴定一个或多个编码具有二萜合酶活性的多肽，特别地编码二萜合酶，特别地编码截短侧耳素合酶的核酸的用途。
15.生产截短侧耳素前体，特别是根据式(I)的化合物的方法，其中所述方法 A)是发酵生产所述前体的方法并包括以下步骤 (i)将至少一个根据权利要求5A或5B的核酸分子和/或至少一个根据权利要求7的载体引入选自细胞、组织和非人生物的宿主，和(ii)在适于发酵生产所述前体的条件下培养宿主。
或者 B)是合成生产所述前体的方法并包括将栊牛儿基栊牛儿焦磷酸与根据权利要求I至4中任一项的多肽或通过权利 要求9的方法可获得的多肽反应。
全文摘要
本发明特别地涉及具有二萜合酶活性的新多肽、编码所述多肽的核酸分子，以及源自Clitopilus passeckerianus的基因簇，此基因簇被认为参与生产截短侧耳素的生物合成途径。
文档编号C12N15/09GK102906253SQ201180023191
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者R·米特鲍尔, T·施佩希特 申请人:桑多斯股份公司