专利名称：乌苏里蝮蛇毒fle基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法
技术领域：
本发明涉及乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。
背景技术：
乌苏里蝮蛇(Gloydius ussuriensis)隶属于爬行纲(Iteptilia)有鳞目 (Squamata) M g (Serpentes)(Viperidae) ^ M (Crotalinae) M yifl B. M (Gloydius)，在我国主要分布在黑龙江、吉林、辽宁(北部)、内蒙古(大兴安岭以东)，是我国东北分布广泛、种群数量最多、毒性强的一种毒蛇，具有重要的经济价值和药用价值。蛇毒成分复杂，含有包括凝血酶、类凝血酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、透明质酸酶、精氨酸酯酶等在内的拥有多种生物活性的酶类。其中，在蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白和纤维蛋白原的酶，称为纤维蛋白溶酶(fibrin(ogen) olytic enzyme，FLE)，简称纤溶酶。蛇毒纤溶酶具有降解纤维蛋白和纤维蛋白原的作用，能够通过抑制第VIII凝血因子影响正常凝血酶的生成。研究表明蛇毒纤溶酶具有明显的抗血栓作用，可用于心脑血栓和心肌梗塞的治疗，可作为一种潜在的强力抗栓剂，目前世界各国正在进行相关的研发工作。
发明内容
本发明提供一种乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列。本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备方法，按以下步骤进行一、构建乌苏里蝮蛇毒FLE基因的真核表达载体ppFASTBACHTa-FLE重组质粒； 二、ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的提取及纯化；三、重组质粒注射小鼠取20 μ g纯化的 ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，用生理盐水稀释到小鼠体重的1/10，小鼠经尾静脉注射稀释的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，在k内注射完毕，他后，将小鼠经颈椎脱白处死，取出肝脏组织，放入生理盐水中；四、真核表达产物的制备采用pH为7. 2的磷酸盐缓冲液清洗小鼠肝脏组织3 5次，然后按照200mg组织/ml的比例向肝脏组织中加入单去污剂裂解液，勻浆，然后于4°C、12000r/min离心lOmin，取上清液，采用亲和层析法进行蛋白纯化，即完成乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备。本发明提供了一个乌苏里蝮蛇毒FLE基因，其编码纤维蛋白溶酶FLE，具有纤溶活性，能够降解纤维蛋白原和纤维蛋白。可用于溶解在心肌梗塞、中风、血栓等期间形成的血凝块，作为一种强有力的抗栓、溶栓药物，将在心肌梗塞、中风、血栓等病症的治疗中发挥重要作用。
图1为具体实施方式
三中真核表达产物的SDS-PAGE电泳结果；图2为具体实施方式
三中真核表达产物的Western blot检测结果；图3为具体实施方式
三中对照组小鼠肝脏组织免疫组织化学检测结果；图4为具体实施方式
三中实验组小鼠肝脏组织免疫组织化学检测结果；图5为具体实施方式
三中真核表达产物的纤溶活性鉴定结果。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列。
具体实施方式
二 本实施方式乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。乌苏里蝮蛇毒FLE基因的获得方法如下一、乌苏里蝮蛇毒腺总RNA的分离1、乌苏里蝮蛇捕捉于黑龙江省牡丹江市，经分类系统检查，确认；2、取材时迅速断取蛇头，用液氮速冻，再贮存于-80°C冰柜中，用时置于冰上，迅速剥离毒腺；3、将毒腺置于液氮中迅速研磨成粉末状，装入冰上预冷的2ml的Eppendorf管内；4、加入450 μ 1的Tris 饱和酚、350 μ 1的氯仿、700 μ 1的2% SDS缓冲液和100 μ 1的β -巯基乙醇，振荡器上剧烈震荡混勻IOmin ；5、4°C，12000r/min离心IOmin ；6、取上清于另一个Eppendorf管中，再加入350 μ ITris饱和酚和350 μ 1氯仿，振荡5min后，4°C，12000r/min离心7min ；7、重复步骤6 一次；8、取上清加入预冷的700 μ 1氯仿，振荡5min,4°C,12000r/min离心7min ；9、 取上清，加入350 μ 1无水乙醇和350 μ 1 8mol/L的LiCl，冰浴lOmin，4°C，12000r/min离心12min ；10、弃上清，12000r/min瞬时离心5S，弃上清；11、将沉淀溶于10 μ 1 DEPC水中贮存，同时进行电泳检测。二、乌苏里蝮蛇毒腺总RNA的纯化按照上海生工生物工程有限公司的RNA抽提试剂盒说明书纯化乌苏里蝮蛇毒腺总 RNA。三、RT-PCR法扩增蛇毒FLE基因采用反转录酶AMV试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)操作，将纯化后的乌苏里蝮蛇毒腺总RNA反转录获得cDNA。以GenBank数据库已发表的短尾蝮蛇纤溶酶的基因序列(GenBank登录号AF176679)为依据，采用DNAMAN软件设计一对引物。Pl为正向引物序列，为方便后续试验的酶切，外设EcoR I酶切位点；P2为反向引物序列，委托大连宝 (TaKaRa)生物工程有限公司合成。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50 μ 1，由下列成分组成
权利要求
1.乌苏里蝮蛇毒FLE基因，其特征在于乌苏里蝮蛇毒FLE基因是下述核苷酸序列之1)序列表中SEQID NO 1的DNA序列；2)编码序列表中SEQID NO 2的DNA序列。
2.权利要求1所述乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白，其特征在于乌苏里蝮蛇毒FLE 基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.权利要求1所述乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备方法，其特征在于乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备方法，按以下步骤进行一、构建乌苏里蝮蛇毒FLE基因的真核表达载体ppFASTBACHTa-FLE重组质粒；二、 ppFASTBACHTa-FLE重组质粒的提取及纯化；三、重组质粒注射小鼠取20 μ g纯化的 ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，用生理盐水稀释到小鼠体重的1/10，小鼠经尾静脉注射稀释的ppFASTBACHTa-FLE重组质粒，在k内注射完毕，他后，将小鼠经颈椎脱白处死，取出肝脏组织，放入生理盐水中；四、真核表达产物的制备采用pH为7. 2的磷酸盐缓冲液清洗小鼠肝脏组织3 5次，然后按照200mg组织/ml的比例向肝脏组织中加入单去污剂裂解液，勻浆，然后于4°C、12000r/min离心lOmin，取上清液，采用亲和层析法进行蛋白纯化，即完成乌苏里蝮蛇毒FLE基因真核表达产物的制备。
全文摘要
乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法，涉及一个乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。其目的是提供一个乌苏里蝮蛇毒FLE基因、其编码蛋白及其真核表达产物的制备方法。该基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO2的DNA序列。乌苏里蝮蛇毒FLE基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。该基因编码纤维蛋白溶酶FLE，具有纤溶活性，能够降解纤维蛋白原和纤维蛋白。可用于溶解在心肌梗塞、中风、血栓等期间形成的血凝块，在上述病症的治疗中发挥重要作用。
文档编号C12N9/68GK102559721SQ20121000200
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者刘玉芬, 刘鹏, 满朝来, 甄鑫, 赵文阁, 陈辉 申请人:哈尔滨师范大学