专利名称：一种诱导干细胞神经分化的方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程技术，涉及一种促进干细胞神经分化的体外诱导方法。
背景技术：
神经系统难治性疾病多由于神经系统损伤导致大量神经元结构和功能的缺失，传统的观点认为神经细胞缺乏再生能力，无法产生新的神经元建立突触联系，神经损伤不可逆转。而近年来研究发现，将干细胞移植到病损或受伤的脑组织中，可产生新的神经细胞， 从结构及功能上对神经系统进行修复和改善。干细胞尤其是成体干细胞作为一种新型的生物治疗方法是医学发展史上一个开创性的探索。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓、外周血和脐血等组织中的一类具有自我更新及跨胚层分化能力的干细胞，体外研究发现，MSCs在特定的诱导环境下可分化为神经样细胞，动物实验也显示骨髓间充质干细胞移植可在中枢神经系统内存活并能分化为有功能的神经样细胞[I]。MSCs取材和体外扩增方便，不受伦理学的限制，具有免疫耐受的优势，体内移植易于控制，为神经系统疾病治疗带来了新的希望。 如何提高MSCs的神经分化效率及功能替代作用是MSCs用于神经系统疾病治疗的关键。
目前，MSCs体外定向成神经诱导有化学诱导法、神经营养因子诱导法、神经细胞共培养法等，这些方法均可实现对MSCs的定向成神经诱导，但各有优劣。其中，Woodbury化学诱导法是目前常用的诱导大鼠MSCs成神经分化的方法，MSCs在体外各种化学诱导剂及生长因子培养条件下向神经样细胞的转化率高达50%-90%，但分化后的细胞多只证实具有神经细胞形态及表面标志的表达，是否具有成熟的神经细胞功能还鲜有报道，且诱导后的神经样细胞极易发生调亡，存活时间短。发明内容
本发明的一个目的在于提供一种诱导干细胞神经分化的方法，能有效促进干细胞神经分化。
本发明的另外一个目的在于提供一种表达相关神经标志蛋白，并具有神经元细胞功能的神经样细胞。
本发明的目的是通过以下措施实现的一种诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于使用全反式维甲酸(all-trans-Retinoic Acid, ATRA)作为诱导剂，改良神经诱导培养基(modified neuronal induction medium, MNM)作为培养基处理干细胞。
为了更有效的促进干细胞神经分化，所述ATRA的浓度优选为lyM。更优选地，所述ATRA诱导时间为24小时。
进一步地，为了提高干细胞向神经元定向分化的分化率和存活率，所述MNM的配方为 2%DMS0，200 u M BHA, 25mM KCL, 2mM 丙戊酸，8uM forsklin, I u M 氢化可的松和 5 y g/ ml胰岛素的DMEM/F12培养液。分化率能达到86%，存活率能达到近100%。
更进一步地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。具体的说，所述骨髓间充质干细胞来源于大鼠。
上述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成1.分离培养及鉴定原代大鼠MSCs2.诱导原代大鼠MSCs分化加入ATRA进行预诱导24小时，再加入MNM诱导24小时。
上述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成I.分离培养及鉴定原代大鼠MSCs :取SPF级4 8周龄SD大鼠，取股骨，5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，离心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青链霉素完全培养基吹打，按3X IO6个/瓶的浓度接种在底面积25cm2的的塑料培养瓶中，置于37°C， 5%C02湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液。随后每3天换液。细胞融合度达80%后胰蛋白酶消化离心，按I :2或I :3的浓度传代，3-5代细胞用于实验。流式细胞技术检测⑶106、⑶90、⑶45、⑶34等干细胞标志。
2. MSCs神经诱导方案的优化MSCs以3X 105/ml浓度接种于培养瓶，培养皿或细胞孔板中，6-8小时细胞贴壁后加入终浓度为0-100 ii M的ATRA进行预诱导,24小时后全量换液去除预诱导液，D-hank’ s洗细胞2_3次，尽量去除残留血清，加入MNM诱导24小时。 光镜下观察细胞存活情况及神经样细胞的形态，计算神经分化效率。Real-time PCR检测神经细胞相关标志的表达水平，胎盘蓝染色实验检测分化后神经样细胞的存活率，确定最佳诱导方案。
3.诱导后神经样细胞的鉴定免疫荧光检测NESTIN、NES、MAP-2、NF等神经元标志 GFAP、⑶68、BNDF等神经表面标志。全细胞膜片钳检测细胞静息电位，钙影像测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
一种具有一定神经元功能的神经样细胞，由上述诱导干细胞神经分化的方法制得。
本发明的有益效果I.本发明诱导干细胞向神经样细胞分化的效率提高22. 66%，干细胞向神经样细胞分化后的存活率提高12. 58%，同时具有较高的分化率和存活率。
2.本发明诱导干细胞更容易向神经元而不是胶质神经细胞分化，分化后的神经样细胞更具有神经元功能。为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外模型，为干细胞用于临床治疗神经系统疾病提供强有力的依据。
图I是原代大鼠MSCs的细胞形态1.光镜，2. H. E染色(100X)图2是流式细胞技术检测第3代MSCs的干细胞表面标志⑶106，⑶90，⑶45，⑶34 图3是MSCs经不同浓度ATRA预诱导24小时再MNM神经诱导24小时的神经样细胞光镜4是MSCs经不同浓度ATRA预诱导后MNM神经诱导24小时NESTIN，NSE, MAP-2的 real-time PCR 检测5是MSCs分化的神经样细胞的神经元及神经胶质细胞相关标志NESTIN，NSE，MAP-2， GFAP，CD68 RT-PCR 检测6是MSCs分化的神经样细胞的神经元及神经胶质细胞相关标志4NESTIN, NSE, MAP-2,⑶NF的免疫荧光检测7是I ii M ATRA预诱导联合MNM诱导MSCs成神经样细胞过程中NETIN、NSE表达的 Western blot 检测8是MSCs及诱导后神经样细胞的细胞静息膜电位比较9是MSCs及诱导后神经样细胞的胞内钙离子浓度比较10是MSCs及诱导后神经样细胞的8分钟动态跟踪340nm/380nm荧光强度比值图
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell, 2001)实施例I第一步，分离培养及鉴定原代大鼠MSCs :取SPF级4 8周龄SD大鼠，无菌条件下取股骨，5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，离心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1% 青链霉素完全培养基吹打，按3xl06个/瓶的浓度接种在25cm2的塑料培养瓶中，置于 370C，5%C02湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，换液后，可见rMSCs呈散在的细胞集落样生长，细胞个体呈扁平梭形，集落中央的细胞形态较圆，集落边缘的细胞为扁平梭形。4 5天左右细胞数量明显增加，集落逐渐扩大。6 7天细胞基本铺满瓶底，形态较均一呈梭形且呈漩涡状生长(见图I)。传代细胞均匀分布，生长迅速，约3 4 天可铺满瓶底，细胞多呈梭形，漩涡状生长。MSC传至第3代，流式细胞技术检测大鼠MSCs 的细胞表面标志取接近融合的第3代MSCs，用胰酶消化后，PBS洗涤3次，制成IXlO6/ ml的单细胞悬液。取100 u I细胞悬液5管a管为标准对照，加IgGl-FITC单克隆抗体， b管加⑶34-FITC单克隆抗体，c管加⑶45-PE单克隆抗体，d管加⑶90-PE单克隆抗体，e 管加CD106-PE单克隆抗体，室温反应30 min，流式细胞仪(FACSCanto TM II system, BD Biosciences)检测。CellQuest Pro software (BD Biosciences)分析结果显不99% 以上的MSC表达⑶106、⑶90，几乎不表达⑶45和⑶34 (见图2)，提示分离获得的骨髓间充质干细胞纯度较高，且没有骨髓造血干细胞混杂。
第二步，不同浓度ATRA预诱导联合MNM对骨髓间充质干细胞神经分化的作用 细胞培养及诱导神经分化采用3-5代的MSCs，初始密度为50%接种于培养瓶或24孔板，DMEM/F12/10%FBS完全培养基培养，4_5小时细胞贴壁后分别加入终浓度为0. 01,0. I、I、10、IOOii M的ATRA，预诱导24小时后，弃去完全培养基，D_hank’ s液洗细胞两次，加入 MNM 神经诱导液(含 2% DMS0, 200 剛 BHA, 20 mM KCL, I. 6 mM 丙戊酸，8 剛 Forskolin, 0. 8 m氢化可的松，4 ^g/ml胰岛素的DMEM/F12无血清培养基)诱导细胞24小时，无ATRA预诱导，仅MNM神经诱导24小时设为对照组。
光镜下观察细胞形态，计算分化效率加入预诱导液24小时内，细胞形态未见明显改变。更换MNM诱导后在倒置显微镜下观察，诱导I小时即可见部分细胞胞体开始收缩， 折光性增强，并逐渐伸出突起，向神经细胞形态转变，随时间推移，细胞胞体收缩更加明显， 突起增多增长。预诱导的ATRA浓度在0.01-10 ii M范围内，ATRA浓度越高，神经样细胞分化效率越高，呈双极或多极神经元细胞形态，神经元胞体直径越大，轴突更长(图3，表1，* p〈0. 05)。IOOMm ATRA预诱导处理的MSC神经分化迅速，但24小时大部分细胞死亡，无法计算神经分化效率。
诱导后神经样细胞的存活率在倒置显微镜下动态观察各诱导阶段细胞状态，未经ATRA预诱导的细胞24小时后可观察到部分神经元表型细胞逐渐脱壁、漂浮、死亡，36小时大部分神经样细胞死亡。台盼蓝染色计算细胞存活率胰酶消化贴壁细胞，收集贴壁及漂浮细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。细胞悬液与0. 08%台盼蓝溶液以I: I混合混匀，加 IOul细胞混合液入计数板,镜下观察,蓝色为死细胞,拒染呈无色透明状为据染的活细胞。 在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。计算细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数 +死细胞总数)X 100%。ATRA预诱导浓度在0. 01-1 u M，神经样细胞24小时的存活率明显增高，而ATRA浓度高于10 u M后，神经样细胞的死亡率反而高于未预诱导组(见图3，表1， * p〈0. 05)。
下表(表I)是不同浓度ATRA预诱导24小时再MNM神经诱导24小时后MSC的神经分化效率，神经元胞体直径，轴突长度和细胞死亡率(*P〈0. 05 vs MNM单独培养组)
权利要求
1.一种诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于使用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)作为诱导剂，改良神经诱导培养基(modified neuronal induction medium, MNM)作为培养基处理干细胞。
2.根据权利要求I所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于所述ATRA的浓度优选为I u M。
3.根据权利要求I或2所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于所述ATRA诱导时间为24小时。
4.根据权利要求3所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于所述MNM的配方为 2%DMS0, 200 u M BHA, 25mM KCL, 2mM 丙戊酸，8 y M forsklin, I u M 氢化可的松和 5 u g/ml 胰岛素的DMEM/F12培养液。
5.根据权利要求I或2所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于所述干细胞为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。
6.根据权利要求5所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于所述骨髓间充质干细胞来源于大鼠。
7.根据权利要求I或2所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成(1)分离培养及鉴定原代大鼠MSCs；(2)诱导原代大鼠MSCs分化加入ATRA进行预诱导24小时，再加入MNM(含 2%DMS0，200 ii M BHA,25mM KCL，2mM 丙戊酸，8 y M forsklin, IuM 氢化可的松和 5 u g/ml胰岛素的DMEM/F12培养液)诱导24小时。
8.根据权利要求7所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成(1)分离培养及鉴定原代大鼠MSCs-M SPF级4 8周龄SD大鼠，取股骨，5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，离心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青链霉素完全培养基吹打，按3X IO6个/瓶的浓度接种在底面积25cm2的塑料培养瓶中，置于37°C， 5%C02湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液；随后每3天换液；细胞融合度达80%后胰蛋白酶消化离心，按I :2或I :3的浓度传代，3-5代细胞用于实验；流式细胞技术检测⑶106、⑶90、⑶45、⑶34等干细胞标志；(2)MSCs神经诱导方案的优化MSCs以3X 106/ml浓度接种于在底面积25cm2的塑料培养瓶中，培养皿或细胞孔板中，6 8小时细胞贴壁后加入终浓度为0-100 ii M的ATRA进行预诱导,24小时后全量换液去除预诱导液，D-hank’s洗细胞2_3次，尽量去除残留血清， 加入 MNM (含 2%DMS0, 200 y M BHA，25mM KCL，2mM 丙戊酸，8 y M forsklin，I y M 氢化可的松和5 u g/ml胰岛素的DMEM/F12培养液)诱导24小时；光镜下观察细胞存活情况及神经样细胞的形态，计算神经分化效率；Real-time PCR检测神经细胞相关标志的表达水平，台盼蓝染色实验检测分化后神经样细胞的存活率，确定最佳诱导方案；(3)诱导后神经样细胞的鉴定免疫荧光检测NESTIN、NES、MAP-2、NF等神经元标志 GFAP,⑶68、BNDF等神经表面标志；全细胞膜片钳检测细胞静息电位，钙影像测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。
9.根据权利要求I或2所述诱导干细胞神经分化的方法制得的具有一定神经元功能的神经样细胞，由上述诱导干细胞神经分化的方法制得。
全文摘要
本发明使用全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)作为诱导剂，改良神经诱导培养基(modifiedneuronalinductionmedium,MNM)作为培养基处理干细胞，能有效促进干细胞神经分化，提高分化率和存活率，制备更具神经元功能的神经样细胞，为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外模型，为干细胞用于临床治疗神经系统疾病提供强有力的依据。
文档编号C12N5/0775GK102533647SQ20121000181
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者张贇, 李廷玉, 毕杨, 陈洁, 魏小平, 龚敏 申请人:重庆医科大学附属儿童医院