一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法及其应用，包括以下步骤：a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50 mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；b、将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；c、将含蛇毒的凝胶磨细后免疫注射家兔，4次免疫注射，之间间隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三、第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清，冷冻保存。本发明保证被免疫动物健康存活、降低抗血清的生产成本、制备出了高效价的抗血清。
【专利说明】
一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法及其应用
技术领域
[0001 ] 一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法及其应用，属免疫技术领域。
【背景技术】
[0002]尖吻蝮蛇acutus)俗称五步蛇，属于蝮亚科、蝮属，分布于我国长江以南地区(包括台湾)，是我国特有剧毒蛇。该蛇毒为血循环型毒蛇，其主要毒素为出血毒素，前人从尖吻蝮蛇毒液中分尚出4种出血毒素，被尖吻蝮蛇咬伤后伤口和内脏大量出血，致死、致残率极高。
[0003]目前治疗尖吻蝮蛇咬伤的有效方法是注射抗血清，传统方法制备全毒抗血清采用福氏佐剂乳化后免疫注射动物的方法，由于乳化后的蛇毒出血活性仍然很强，因此，注射的抗原量比较小，否则被免疫的动物就会死亡，抗原量小导致抗血清效价低，因此治疗效果不佳。制备高效价全毒抗血清对于有效治疗尖吻蝮蛇咬伤，降低致死和致残率有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明旨在利用尖吻蝮蛇毒的出血毒素都含Ca2+，Na2EDTA可以通过螯合Ca2+使出血活性丧失、抗原性仍然保留的特点，全毒中加入Na2EDTA消除出血活性，然后将无出血活性的蛇毒蛋白包围到网状的聚丙烯酰胺凝胶中，将含蛇毒蛋白的凝胶磨细后免疫注射家兔，获得高效价的抗尖吻蝮蛇全毒抗血清。
[0005]本发明采用的具体技术方案如下:
一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；
b、蛇毒蛋白的包埋将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中；
C、将含蛇毒的凝胶磨细后免疫注射家兔，4次免疫注射，之间间隔7天，第四次注射后取血，6小时后离心获得抗血清。
[0006]所述的尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法制得的抗血清。
[0007]所述的抗血清在治疗尖吻蝮蛇咬伤患者上的应用。
[0008]本发明技术效果体现在几个方面:
1、保证被免疫动物健康存活
由于出血活性被抑制，注射部位不会发生出血和坏死，因此，被注射动物不会因为抗原的副作用而死亡，保证了制备抗血清实验的成功。
[0009]2、不使用昂贵的福氏佐剂，降低抗血清的生产成本
本发明将蛇毒蛋白包埋在网状的聚丙烯酰胺凝胶中，蛇毒蛋白从网状的聚丙烯酰胺凝胶中缓慢释放到动物体内，用这种方法不但抗原在动物体内停留时间长，充分刺激免疫系统，而且用聚丙烯酰胺凝胶替代了昂贵的福氏佐剂。
[0010]3、制备的抗血清效价高
通过比较，本发明比传统方法制备的抗血清效价高出2.5倍，因此注射同等量的抗血清治疗效果大大提高，如果少注射抗血清，则可以降低异原血清对人体的副作用。
【具体实施方式】
[0011]实施例一:
第一步:尖吻蝮蛇出血活性的抑制
取5mL体积的干净塑料管，将0.1g尖吻蝮蛇原溶解于2.0 mL 0.1M Tris-HCKpH 8.8)缓冲液中，加50 mg Na2EDTA并充分溶解；
第二步:蛇毒蛋白的包埋
将上述无出血活性的溶液加入1.4mL 30%丙烯酰胺、50uL 10 %过硫酸铵、2uL四甲基乙二胺(TEMED)，充分混匀，沿试管壁缓慢加入0.5mL异丙醇，I h后凝固，去除异丙醇，取出胶体用手术刀评分成4份，每份约I g，冷冻保存；
第三步:注射免疫家兔，获得抗血清
取I份上述胶体，加2.0 mL生理盐水，于研钵内充分磨细，吸入到5mL规格的一次性注射器中，总体积约3.5mL，免疫注射2.5kg左右的家兔，共注射4次，二次之间间隔7天，第一次注射皮下注射1.25mL，腹腔注射2.25mL，第二、第三、第四次注射均腹腔注射3.5mL，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清，冷冻保存。
[0012]第四步:抗血清效价的测定抗血清效价的测定与ELISA方法相似。
[0013]将尖吻蝮蛇原毒用包被液(0.1mol/LpH 9.5的碳酸盐缓冲液)配制成10yg/mL作为抗原样品，将待测抗血清进行倍比稀释，以不含尖吻蝮蛇毒的包被液代替抗原样品为空白，以未免疫的家兔血清替代待测抗血清作为阴性对照，用制备的抗血清作为一抗，羊抗兔IgG-碱性磷酸酶为二抗，I mg/mL的p-NPP为底物，显色45分钟后在酶标仪上测定0D4Q5值，以空白对照调零，待测抗血清的吸光值2倍于阴性血清吸光值的效价定为I，通过计算抗血清的稀释倍数计算未稀释前抗血清的效价。ELI SA检测的大致步骤如下:
(I)抗原包被:酶标板每孔加200yL包被抗原，酶标板置4°C冰箱过夜。
[0014](2)封闭:加封闭液，每孔200 yL ,37 °C孵育I h。
[0015](3)加一抗:加入倍比稀释的抗血清(ELISA缓冲液稀释)，阴性为未免疫的家兔血清，37 0C孵育I h0
[0016](4)加酶标二抗:所有酶标板孔加入1/10000的羊抗兔IgG-碱性磷酸酶(Sigma，ELISA缓冲液稀释)，37 °C孵育I h。
[0017](5)加底物:1 mg/mL的p-NPP(Sigma，溶于底物缓冲液，pH 9.8),37 °C黑暗中孵育30 min，测0D4Q5值。
[0018]经过计算，“实施例一”制备的抗血清效价达到510，而用常规蛇毒加福氏佐剂乳化制备的抗血清效价只有200，可见本发明制备的抗血清效价提高约2.5倍。
[0019]实施例二:
第一步:尖吻蝮蛇出血活性的抑制
取5mL体积的干净塑料管，将0.09g尖吻蝮蛇原溶解于1.8mL 0.1M Tris-HCKpH 8.8)缓冲液中，加40mgNa2EDTA并充分溶解；
第二步:蛇毒蛋白的包埋
将第一步获得的无出血活性的溶液加入I.3mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %过硫酸铵、2uLTEMED，充分混匀，其他步骤与“实施例一”第二步相同；
第三步:注射免疫家兔，获得抗血清与“实施例一”第三步相同。
[0020]第四步:抗血清效价的测定检测过程与“实施例一”第四步相同。
[0021]经过计算，“实施例二”制备的抗血清效价达到550，而用常规蛇毒加福氏佐剂乳化制备的抗血清效价只有200，可见本发明制备的抗血清效价提高约2.6倍。
[0022]实施例三:
第一步:尖吻蝮蛇出血活性的抑制
取5mL体积的干净塑料管，将0.1lg尖吻蝮蛇原溶解于2.2mL 0.1M Tris-HCKpH 8.8)缓冲液中，加60mgNa2EDTA并充分溶解；
第二步:蛇毒蛋白的包埋
将第一步获得的无出血活性的溶液加入I.5mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %过硫酸铵、2uLTEMED，充分混匀，其他步骤与“实施例一”第二步相同；
第三步:注射免疫家兔，获得抗血清与“实施例一”第三步相同。
[0023]第四步:抗血清效价的测定
抗血清效价的测定与ELISA方法相似。检测过程与“实施例一”第四步相同。
[0024]经过计算，“实施例三”制备的抗血清效价达到510，而用常规蛇毒加福氏佐剂乳化制备的抗血清效价只有200，可见本发明制备的抗血清效价提高约2.5倍。
[0025]本发明用不同剂量的尖吻蝮蛇毒，采用Na2EDTA消除出血活性，聚丙烯酰胺凝胶包埋代替乳化，均获得稳定和满意的结果，说明该技术实用、可靠。
【主权项】
1.一种尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤:a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性； b、蛇毒蛋白的包埋将经过Na2EDTA处理的无出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝胶中； C、将含蛇毒的凝胶磨细后免疫注射家兔，4次免疫注射，之间间隔7天，第四次注射后第3天以切断颈动脉方式杀死家兔取血，6小时后离心获得抗血清。2.权利要求1所述的尖吻蝮蛇毒高效价抗血清的制备方法制得的抗血清。3.权利要求2所述的抗血清在治疗尖吻蝮蛇咬伤患者上的应用。
【文档编号】A61K39/395GK106008713SQ201610633985
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月5日
【发明人】韦传宝
【申请人】安徽威尔试剂盒科技有限责任公司