检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，属于单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检验检疫领域。
背景技术：
随着世界经济全球化、贸易自由化和食品国际贸易的迅速发展，食品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题。而食源性疾病在食品安全问题中又占据非常重要的地位。WHO将食源性疾病定义为存在于自然界中的有污染性或毒性的因子(包括病毒、寄生虫、细菌和农业、环境、危险化学品以及生物毒素)通过进食而进入身体引起的疾病(任玉华，田海霞.食品安全与食源性疾病[J].职业与健康，2005，21 (12)1977-1978.)。爆发的食源性疾病中多数是由致病性细菌引起(张敏，童华荣，张丽平.动 物性食品安全现状及其对策[J].食品工业科技，2005 (5) :182-186)。其中，单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌是比较重要的两种食源性致病菌(刘圆圆.沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌的同步快速检测方法的研究[D].华南理工大学，2010，1-86)。单增李斯特菌是一种能引起人畜共患的致病菌，致死率高达30%，对于免疫缺陷病人致死率甚至高达70%。该菌在欧美日等发达国家的危害程度甚至超过沙门氏菌食物中毒。根据美国疾病控制中心的研究报告估计，美国每年有7600万人食物中毒，约有5000人死于食物中毒，其中单增李斯特菌、出血性大肠杆菌0157:H7和多种抗生素耐药性鼠伤寒沙门氏菌引起的食源性疾病最为突出(张兰荣，唐一清，甄博捃，等.通州区6类食品单增李斯特菌污染状况及分子流行病学特征调查研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17 (12)2306-2308)。WHO关于单增李斯特菌食品中毒报告中指出，各类产品中，新鲜肉类及肉类制品中含有单增李斯特菌的比例最高(何欣荣等，2002)。金黄色葡萄球菌是人和动物的常见病原菌，在自然界中无处不在。在美国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒33%，加拿大则更多，占45%。中国每年发生的此类中毒事件也非常多。2003年中国食源性疾病暴发的监测资料分析显示，在微生物食源性疾病爆发中，金黄色葡萄球菌占9. 4%，仅次于副溶血弧菌和变形杆菌。且报道显示，引起食源性疾病的动物类食品中以肉及肉制品最多，高达68% (刘秀梅，陈艳，樊永祥，等.2003年中国食源性疾病暴发的监测资料分析[J].卫生研究，2006，35 (2)201-204)。有鉴于此，开展食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌同步、快速检测方法的研究具有重要意义。目前较为常用的检测方法是传统分离鉴定方法和普通PCR方法。但传统的分离鉴定方法，操作繁琐，耗时耗力，不能满足快速检测的需求(Churchill R L T,LeeHiHall J C. Detection of Listeriamonocytogenes and the toxin listeriolysin 0 infood. Journal of M icrobiological Methods，2006，64 (2) :141170)。常规 PCR 法需要琼脂糖凝胶电泳后续处理，费时费力，还增加了对环境造成污染的可能性。迄今为止，尚缺乏一种灵敏性高、稳定性好的能够同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒及检测方法。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒；本发明的目的之二是提供一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，包括Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针。 其中，所述的一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo. I和SEQ ID No. 2所示，所述的一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示，在SEQ ID No. 3所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。所述的一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示，在SEQ ID No. 6所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3^端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是J0E，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。JOE的吸收发射波长与FAM的吸收发射波长不交叉，两条探针可用Mx3005P荧光定量PCR仪同时检测，且荧光信号互不影响。此外，两条探针3'端选用Eclipse非荧光淬灭基团，本身不产生荧光且淬灭效率更高，大大降低了本底信号的强度。所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有25mM的dNTPs和25mM的Mg2+ ；为了达到更好的检测效果，上述试剂盒中还可含有单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒作为阳性标准模板，所述的单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒可以通过各种商业途径购买得到，本领域技术人员也可按照本领域的常规技术手段制备得到单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒；此外，本发明试剂盒中还可含有阴性质控标准品。基于目前尚缺乏用于食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌同步且定量的检测方法，本发明的另一目的是提供一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，实现对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同步、快速、特异、定量的检测，为食品中食源性致病菌的高通量检测奠定基础。本发明的另一目的是通过以下技术方案来实现的一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，包括以下步骤(I)提取待检测食品的DNA; (2)在PCR扩增管中加入以下试剂建立PCR扩增体系所提取的待检测食品的DNA，Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物引物和一条检测金黄色葡萄球菌的探针；(3)将所建立的PCR扩增体系在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，根据扩增曲线、标准曲线或/和Ct值对样品中的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性分析和定量分析。至于如何对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性和定量分析，这些分析方法或手段属于本领域的常规技术手段，为本领域技术人员所公知道。作为参考，本领域技术人员可采用以下方式进行定性分析和定量分析定性分析首先设定阈值；阈值样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且尽量使回归系数最大；也就是在扩增曲线的指数期划一条直线，这条线就叫阈值线；例如，选择荧光检测模式为FAM和J0E，基线调整取3-15个循环的荧光信号设为阈值；如果PCR扩增曲线超过设定的阈值即为阳性，即说明检测到目的菌。如果PCR扩增曲线在阈值线以下即为阴性，即说明没有检测到单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌。定量分析首先建立标准曲线将阳性标准模板进行梯度稀释后进行PCR扩增，以标准阳性模板的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线(Ct值PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。)。 将待扩增的样品与阳性标准模板相同的PCR扩增体系和扩增条件进行PCR扩增，在荧光定量PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期，在指数期，PCR每进行一个循环，产生的DNA拷贝数呈2倍指数方式增加，随着反应循环数的增加，最终PCR进入平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，最后通过标准曲线和Ct值对检测样品进行定量分析。所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有25mM的dNTPs和25mM的Mg2+ ；为了达到更好的分析效果，所述的扩增体系中还可加入单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌的标准质粒作为标准模板(阳性对照)；此外还可以在上述扩增体系中加入阴性质控标准品(例如沙门氏菌等)。其中，所述的一对扩增单增李斯特菌上、下游引物引物的核苷酸序列分别为SEQID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示，在SEQ ID No. 3所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3^端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。所述的一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示，在SEQ ID No. 6所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3^端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是J0E，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。如何确定扩增体系中各组分的用量或体积，本领域技术人员可根据经验并视实际情况进行调配，均属于本领域技术人员所熟练掌握的技术，各种组分的用量高低均不影响本发明的实现，作为参考，所建立的扩增体系中各组分的用量可参考以下用量所提取的待检测食品的DNA2-6体积，Taq DNA聚合酶2_15体积，荧光定量PCR扩增缓冲液O. 1-1体积，灭菌去离子水1-10体积，扩增单增李斯特菌的上游引物O. 1-1. O体积，扩增单增李斯特菌的下游引物O. 1-1. O体积，检测单增李斯特菌的探针O. 5-1. 5体积，扩增金黄色葡萄球菌的上游引物0.1-1. O体积，扩增金黄色葡萄球菌的下游引物O. 1-1. O体积，检测金黄色葡萄球菌的探针O. 5-1. 5体积；优选的，各组分的体积如下所提取的待检测食品的DNA 4 μ L，50 X TaqDNA聚合酶12. 5 μ L，50 X荧光定量PCR扩增缓冲液O. 5 μ L，灭菌去离子水4. O μ L，扩增单增李斯特菌的上游引物O. 5 μ L，扩增单增李斯特菌的下游引物O. 5 μ L，检测单增李斯特菌的探针I. O μ L，扩增金黄色葡萄球菌的上游引物0.5 μ L，扩增金黄色葡萄球菌的下游引物O. 5 μ L，检测金黄色葡萄球菌的探针l.OyL;其中，所述的扩增单增李斯特菌的上、下游引物的浓度优选为10 μ M ;所述的扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的浓度优选为10 μ Μ。步骤(3)中所述的扩增优选在以下参数条件下进行PCR扩增95°C预变性30S，95°C变性5S，56°C退火20S，72°C延伸15S，扩增40个循环。

本发明首先针对单增李斯特菌的特异毒力基因hlyA和金黄色葡萄球菌的特异毒力基因nuc分别设计特异性引物和TaqMan探针，在此基础上，分别构建单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的单一荧光定量PCR检测方法，以此来鉴定所设计的特异性引物和探针的特异性和敏感性，然后进一步建立单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法，制备标准曲线，分析反应的敏感性。试验结果显示，本发明所建立的两条标准曲线的相关性较好，相关系数分别范围O. 997和O. 998，且单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的最低检出限分别为19. 5拷贝/ μ L和18. 7拷贝/ μ L，本发明实现了对这两种食源性致病菌的同步、快速、定量检测。本发明利用了多重荧光实时定量PCR的原理，兼顾了 PCR技术的高效性、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点，达到了同步且定量检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的目的，为提高食品监管效率和水平，预防食物中毒和食源性疾病的发生提供保障，同时也为提高国内生产加工环节食品安全风险监测、分析与风险预警的能力和水平奠定基础。


图I不同退火温度下单增李斯特菌PCR扩增产物；M DNA分子量标准；1_10退火温度分别为 51. 6。。、52· 2。。、53· 4°C>54. 8°C>56. 2°C>57. 7°C>59. I °C>60. 6°C>61. 8°C>62. 4°C ；11阴性对照。图2不同退火温度下金黄色葡萄球菌PCR扩增产物；M DNA分子量标准；1_10退火温度分别为 51. 6 0C >52. 20C >53. 40C >54. 80C >56. 2 0C >57. 7°C >59. I °C >60. 6°C >61. 8 °C >62. 4°C ；11阴性对照。图3重组质粒pMD18_hlyA鉴定结果；M DNA分子量标准；I重组质粒pMD18_hlyA ；2阴性对照。图4重组质粒pMD18_nuc鉴定结果；M DNA分子量标准；1重组质粒pMD18_nuc ；2阴性对照。图5质粒pMD18_hlyA的测序结果与原始序列比对图。图6质粒pMD18_nuc的测序结果与原始序列比对图。图7单增李斯特菌荧光定量PCR特异性分析；横坐标扩增循环数(Cycles);纵坐标突光强度(fluorescence) (dRn)。图8金黄色葡萄球菌荧光定量PCR特异性分析；横坐标扩增循环数(Cycles);纵坐标突光强度(fluorescence) (dRn)。图9质粒pMD18_hlyA的敏感性检测扩增曲线；质粒pMD18_hlyA从左至右的浓度依次为Io6UO5UO4UO3UO2UO1拷贝/ μ L ;横坐标扩增循环数(Cycles);纵坐标突光强度(fluorescence)(dRn)。图10质粒pMD18_hlyA荧光定量PCR扩增的标准曲线；横坐标初始模板量(拷贝数)，(initial quantity) (Copies);纵坐标Ct 值(dRn)。图11常规PCR检测质粒pMD18_hlyA的敏感性；M DNA分子量标准；1-7质粒pMD18-hlyA 的浓度依次为106、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、10 拷贝 / yL;8 :阴性对照。

图12质粒pMD18_nuc的敏感性检测扩增曲线；质粒pMD18_nuc从左至右的浓度依次为106、105、104、IO3UO2UO1拷贝/ y L ;横坐标扩增循环数(Cycles);纵坐标突光强度(fluorescence)(dRn)。图13质粒pMD18_nuc荧光定量PCR扩增的标准曲线；横坐标初始模板量(拷贝数)，(initial quantity) (Copies);纵坐标Ct 值(dRn)。图14常规PCR检测质粒pMD18-nuc的敏感性；M DNA分子量标准；1-7质粒pMD18-nuc 的浓度依次为ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、10 拷贝 /μ L ；8 :阴性对照。图15pMD18_hlyA和pMD18_nuc的敏感性检测扩增曲线；pMD18_hlyA从左至右的浓度依次为Io6UO5UO4UO3UO2UO1拷贝/ μ L ;横坐标扩增循环数(Cycles);纵坐标突光强度(fluorescence) (dRn)。图16pMD18_hlyA和pMD18_nuc双重荧光定量PCR扩增的标准曲线；横坐标初始模板量(拷贝数)(initial quantity) (Copies);纵坐标Ct 值(dRn)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验例I引物、探针的设计合成及单一荧光定量PCR方法的建立一、引物、探针的设计与合成根据GenBank发表的单增李斯特菌(LM)的溶血素O hlyA基因序列(AF253320)和金黄色葡萄球菌(SA)的耐热核酸酶nuc基因序列(EF529607)设计引物和探针，具体序列见表I。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。两条TaqMan探针的标记选择上，其中LM-P探针的5'端采用FAM标记作为荧光报告基团。另一条SA-P探针的5'端选择与FAM的吸收发射波长不交叉的JOE作为标记。两条探针可用Mx3005P荧光定量PCR仪同时检测，且荧光信号互不影响。此外，两条探针3'端选用Ecl ipse非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，且淬灭效率更高，大大降低了本底信号的强度。表I引物和探针序列
权利要求
1.一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，包括Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针；其特征在于所述的一对扩增单增李斯特菌引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示；所述的一对扩增金黄色葡萄球菌引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示。
2.按照权利要求I所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有dNTPs和Mg2+。
3.按照权利要求I所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于在SEQ ID No. 3所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse ；在SEQ ID No. 6所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是JOE，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。
4.按照权利要求1-3任何一项所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于含有单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒；此外，该试剂盒还含有阴性质控标准品。
5.一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，包括以下步骤(I)提取待检测食品的DNA ；(2)建立PCR扩增体系所提取的待检测食品的DNA, Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针；(3)将所建立的PCR扩增体系在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，根据扩增曲线、标准曲线或/和Ct值对样品中的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性或定量分析；其中，所述的一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示；所述的一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示。
6.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有dNTPs和Mg2+ ;在SEQ ID No. 3所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse ；在SEQ ID No. 6所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是JOE，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。
7.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于所述的定性分析包括以下步骤设定阈值；如果PCR扩增曲线超过设定的阈值即为阳性，说明待检测样品中检测到单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌；如果PCR扩增曲线在阈值线以下即为阴性，说明待检测样品中没有检测到单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌；所述的定量分析包括以下步骤建立标准曲线将阳性标准单增李斯特菌模板或阳性标准金黄色葡萄球菌模板进行梯度稀释后进行PCR扩增，以标准阳性模板的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标分别建立单增李斯特菌或金黄色葡萄球菌的标准曲线；按照阳性标准模板相同的PCR扩增体系和扩增条件，将待扩增的样品进行PCR扩增，确定Ct值；通过标准曲线和所确定的Ct值对检测样品进行定量分析。
8.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于所述的扩增体系中加入单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌的标准质粒作为标准模板；此外还在所述扩增体系中加入阴性质控标准品。
9.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于所建立的扩增体系中各组分的用量为所提取的待检测食品的DNA2-6体积，Taq DNA聚合酶2_15体积，荧光定量PCR扩增缓冲液0. 1-1体积，灭菌去离子水1-10体积，扩增单增李斯特菌的上游引物0.1-1. 0体积，扩增单增李斯特菌的下游引物0. 1-1. 0体积，检测单增李斯特菌的TaqMan探针0. 5-1. 5体积，扩增金黄色葡萄球菌的上游引物0. 1-1. 0体积，扩增金黄色葡萄球菌的下游引物0. 1-1. 0体积，检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针0. 5-1. 5体积；优选的，各组分的用量如下所提取的待检测食品的DNA 4 U L, Taq DNA聚合酶12.5uL,50X荧光定量PCR扩增缓冲液0. 5 ii L，灭菌去离子水4. 0 y L，扩增单增李斯特菌的上游引物0. 5 ii L，扩增单增李斯特菌的下游引物0. 5 ii L，检测单增李斯特菌的TaqMan探针I. Oy L，扩增金黄色葡萄球菌的上游引物0.5 yL，扩增金黄色葡萄球菌的下游引物0.5 UL,检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针l.OyL;其中，所述的扩增单增李斯特菌的上、下游引物的浓度为IOyM ;所述的扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的浓度为10 PM。
10.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于步骤(3)中所述的PCR扩增在以下参数条件下进行扩增95° C预变性30S，95° C变性5S，56° C退火20S，72° C延伸15S，40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用，该试剂盒包括TaqDNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的引物和一条TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的引物和一条TaqMan探针。本发明利用多重荧光实时定量PCR的原理兼顾PCR技术的高效性、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点，达到了同步且定量检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的目的，为提高食品监管效率和水平、预防食物中毒和食源性疾病的发生提供保障。同时，本发明也为提高生产加工环节食品安全风险监测、分析与风险预警能力和水平等奠定了基础。
文档编号C12R1/01GK102676647SQ20121003083
公开日2012年9月19日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者于国萍, 张秀玲, 许岩, 赵艳丽, 边亚娟, 邵美丽 申请人:东北农业大学