本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的方法。
背景技术：
单增李斯特菌是一种广泛分布于自然界的人畜共患食源性致病菌，它能引起人畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎、和单核细胞增多，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。该菌可广泛存在于多种食品中，如肉制品、奶制品、水产品、蔬菜等，该菌在欧美国家曾导致多次的大规模食物中毒，因此对食品中单增李斯特菌的快速检测非常必要，有效控制食品中的单增李斯特菌，是食品安全的重要课题之一。
金黄色葡萄球菌是食源性及医源性致病菌，对各种理化因素都有较强的抵抗力，且易污染肉类、乳品等食品，广泛存在于自然环境中，它产生的肠毒素是引起食物中毒的主要致病因子，引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占较大比例。研究金黄色葡萄球菌在食品中的污染状况，为预防由其引起的食源性疾病的暴发、流行及追踪污染源提供依据。
目前单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测方法，还主要依赖于传统的微生物学检测方法。传统的国标检测法（gb4789.10和gb4789.30）至少2-5天才能出结果，需要经过增菌、培养基培养、分离、检测等，操作和步骤繁琐、费时，分离率低，而且只能检测样品中存活的菌体，检出率较实际样品中的含量低，极易出现假阴性结果，危害广大消费者安全。因此，提出一种快速检测这两种细菌的方法和手段，对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行快速检测十分必要，以及早发现传染源，切断传播途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种快速检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的方法，以及早发现传染源，切断传播途径。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
（1）无菌条件下取样品，加入到含牛血清白蛋白第五组分（bsav）的磷酸盐缓冲液中均质得样品均液；
（2）低温离心样品均液收集菌体，向收集的菌体内加入生长液，振荡混匀使生长液与菌液充分结合，形成菌悬液，取免疫磁珠与菌悬液均匀混合、水浴热处理灭杀非目标菌后，于磁力架上静置分层，弃上清，加洗脱液洗涤下层样品，得样品待测液，涂于平板上培养、观察检测。
优选地，步骤（1）中，所述样品与磷酸盐缓冲液的用量比为1:9，所述磷酸盐缓冲液中牛血清白蛋白第五组分的质量浓度为1%～10%。
优选地，所述生长液由95wt%脱脂奶、65wt%四甲基戊二酸、40wt%萘乙酸钠和0.15wt%氯化铵按照体积比4:3:3:2混成；所述生长液与样品均液体积比为1：（1～50）。
优选地，步骤（2）中，所述低温离心的温度为4℃、转速为8000rmp。
优选地，步骤（2）中，所述振荡时间为1min～10min，振荡方式为超声波振荡；所述水浴热处理温度为36℃～60℃，水浴时间为10min～60min。
优选地，所述免疫磁珠是通过链霉亲和素修饰磁珠后偶联生物素标记的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌抗体制得，包括以下步骤：
a）用0.01mol/l含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（pbst缓冲液，ph7.4，tween-20）稀释单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌抗体到1mg/ml；用无水dmso配制10mg/ml生物素n—羟基琥珀酰亚胺酯溶液（bnhs溶液），bnhs溶液加入稀释的抗体中进行混合，bnhs溶液与抗体稀释液体积比为4:1，室温下，孵育，即得生物素标记的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌抗体；
b）然后加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，室温放置；
c）再加入9.6μl1mol/lnh4cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以pbs缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入pbs缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。
由于高浓度的bnhs溶液会导致多个生物素分子结合在抗体上，可能会使所有抗体都被标记，较低的浓度则会使生物素化保持在最低限度，因此免疫磁珠制备时，选择用无水dmso配制10mg/mlbnhs；由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此时可加入去污剂如tween20，将抗体溶液用pbst缓冲液洗脱，除去未结合的生物素，防止在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，抑制标记反应。
优选地，步骤（1）中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/l；步骤（2）中，所述的洗脱液为0.02mol/l磷酸盐缓冲液，洗脱次数为2～3次。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
（1）本发明将bsav（生物技术级）加入到缓冲液中，阻止蛋白、脂肪等大分子干扰物，使样品中的目标菌更加稳定的生长，并在后续的试验中减少洗脱率，减少杂质，可有效地选择性保护菌体。
（2）本发明的生长液由95%脱脂奶、65%四甲基戊二酸、40%萘乙酸钠、0.15%氯化铵组成，其中95%脱脂奶能够保护蛋白，起到保护剂的作用，0.15%氯化铵能够去除菌悬液中的杂质，65%四甲基戊二酸是促进生长剂，能够促进与样品更好地结合，萘乙酸钠具有促进细胞快速膨大的功能，低温离心收集菌体后加入生长液，可以促使目标菌快速生长，缩短培养时间，并解决了低水平的病原微生物的检测问题，增大了目标菌的检出率。
（3）本发明利用免疫磁珠能同时特异性地捕获单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌，将目标菌从样品中快速分离，以降低对检测准确性的干扰，有效避免或减少假阳性现象的发生，并实现同步检测两种目标菌，减少检测时间。
综上，本发明中检测方法的检测率高和灵敏度都较高，可全面检测样品中存在的目标菌，避免出现假阴性现象的发生，减少对广大消费者的危害。同时，本发明提供的检测方法操作简单、准确高效，与传统分离培养相比，利用生长液和免疫磁珠，可以有效减少増菌液培养时间和平板培养时间，缩短了整个检测时间，由传统方法的48h～96h缩短至12～48h。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
制备免疫磁珠
免疫磁珠是通过链霉亲和素修饰磁珠后偶联生物素标记的单增李斯特和金黄色葡萄球菌抗体制得，包括以下步骤：
a）用0.01mol/lpbst缓冲液（ph7.4，tween-20）稀释单增李斯特和金黄色葡萄球菌抗体到1mg/ml；用无水dmso配制10mg/ml生物素n—羟基琥珀酰亚胺酯溶液（bnhs溶液），bnhs溶液加入稀释的抗体中进行混合，bnhs溶液与抗体稀释液体积比为4:1，室温下，孵育，即得生物素标记的单增李斯特和金黄色葡萄球菌抗体；
b）然后加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，室温放置；
c）再加入9.6μl1mol/lnh4cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以pbs缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入pbs缓冲液与0.01%叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。
实施例1basv浓度的筛选
1.1单增李斯特菌
分别6份取225ml含有不同浓度的basv的pbs缓冲液（pbs浓度为0.02mol/l）于均质袋中，每个均质袋内加入25g含有单增李斯特菌的样品均质30s，添加basv的浓度分别为0%（未添加basv）、0.5%、1%、5%、8%和10%。
另外，再取225ml李氏增菌肉汤lb1作为对比液，加入25g含有单增李斯特菌的样品均质30s制成样品液作为对比例。
按照传统检测方法，分别对上述样品液进行增菌、划线分离、鉴定等操作，得出试验结果，结果表1所示。
金黄色葡萄球菌
参考单增李斯特菌上述实验过程，与上述实验过程的不同之处在于：选用含有金黄色葡萄球菌的样品实验；对比例中采用7.5%氯化钠肉汤作为对比液，其余操作相同，结果见表1。
表1选用不同缓冲液浓度的试验结果
从表1结果可知经含有1%bsav的pbs缓冲液培养后可检测到的菌落数最高，而继续增加其浓度，菌落数也并未进一步提高，因此bsav的浓度优选为1%。
实施例2生长液的最佳加入量
分别取含有单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌阳性样品25g，加入到含有1%basv的225mlpbs缓冲液的均质袋中，均质30s。取6份5ml样品菌液，4℃、8000rpm离心后收集菌体，分别加入生长液0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml、5ml，混匀。然后分别涂于两种细菌对应的平板上，按照gb4789进行划线分离、生化试验等操作，得出试验结果，如表2所示，表中同时选用gb4789的全流程检测方法作为对比。
表2加入不同量生长液的菌落检测结果
由表可看出，随着生长液的增加，细菌数也随之增加，当生长液为1ml时，细菌生长状态最多，辨别出的阳性菌落数也最多；若继续增加生长液数量，细菌数也不会增多，并且不能明显区分阳性菌落；而生长液添加量低时，菌落数较少，因此生长液的加入量优选为1ml。
实施例3超声振荡混合最佳时间
取含有单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌阳性样品25g，分别加入到含有1%basv的225mlpbs缓冲液的均质袋中，均质30s。取5份5ml样品菌液，4℃、8000rpm离心后收集菌体，加入1ml生长液，将生长液与菌液混合，并分别超声振荡，5个样品振荡时间依次为1min、3min、5min、8min和10min，振荡后涂于两种细菌对应的平板上进行划线分离培养等操作，检测结果如表3所示。
表3超声振荡不同时间检测的菌落数
结果显示，振荡混合时间为5min时，检测到的菌落数最多，增加时间，菌落数未随时间的增长而增多；若振荡时间过长，会使已经连接到免疫磁珠上的菌体蛋白或复合物发生断裂，不利于后期免疫磁珠的快速聚集；而太短不能完全分离，浪费了菌液，最终降低结果的准确度。因此，振荡混合时间优选5min。
实施例4灭菌最优水浴温度
首先，分别取含有单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌阳性样品25g，加入盛有225ml1%bsav的pbs无菌均质袋中，均质30s。
然后，取4份5ml样品菌液，4℃、8000rpm离心后收集菌体，加入1ml生长液，振荡5min混匀形成菌悬液。
再取4份200μl免疫磁珠分别与4份菌悬液均匀混合，水浴温度分别设为36℃、45℃、60℃和70℃，杀灭非目标菌。
静置磁力架上2min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清，分别加入1ml0.02mol/lpbs洗脱液，充分混匀，以上步骤重复3次后，加入100μl0.02mol/lpbs震荡重悬磁珠，得到样品待测液，分别取100μl涂于两种细菌对应的平板上，按照gb4789进行划线分离等操作，在不同显色平板上检测到菌落数如表4所示。
表4不同水浴温度的检测菌落数
由表4可知，细菌数并不是随着水浴温度的增加而增加，水浴温度超过60℃后细菌并未增加，是因为水浴温度过高不仅不利于反应的进行，同时容易使免疫磁珠与菌悬液结合上的蛋白裂解；而水浴温度过低达不到清除非目标菌的目的。当水浴温度为60℃时，检出李斯特菌和金黄色葡萄球菌的菌落数最多，因此灭菌时水浴温度优选为60℃。
实施例5灭菌最优水浴时间
快速检测单增李斯特和金黄色葡萄球菌的方法，步骤如下：
（1）分别取出含有单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌阳性样品25g，加入盛有225ml1%bsav的pbs无菌均质袋中，均质30s。
（2）取5份5ml样品菌液，4℃、8000rpm离心后收集菌体，加入生长液1ml，振荡5min混匀形成菌悬液。然后分别加入200μl免疫磁珠均匀混合，5份样品分别于水浴60℃热处理10min、20min、30min、45min和60min，杀灭非目标菌。静置磁力架上2min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清，加入1ml0.02mol/lpbs洗脱液，充分混匀，以上步骤重复3次后，加入100μl0.02mol/lpbs震荡重悬磁珠，得到样品待测液，分别取100μl涂于两种细菌对应的平板上。
（3）按照gb4789进行划线分离等操作，然后检测，结果如表5所示。
表5不同水浴时间的检测菌落数
结果表明，随着水浴时间的增加，细菌数也随之增加，当水浴时间为20min，细菌生长状态最多；若继续增加水浴时间，会导致非特异性反应的增加；而水浴时间过短不能充分结合目标菌，因此灭菌时水浴热处理时间优选为20min。
实施例6免疫磁珠敏感性试验
将单增李斯特菌和金黄葡萄球菌菌液，按一定梯度进行倍比稀释。每一梯度均进行传统平板培养计数作为对照组。
另取单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌免疫磁珠（5mg/ml）100μl，分别加入到1ml的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌稀释液中，充分混匀后60℃热处理20min，静置磁力架上2min，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清，加入1ml0.02mol/lpbs洗脱液，充分混匀，静置磁力架上2min，待磁珠充分被吸附，弃上清，重复洗涤3次，加入100μl0.02mol/lpbs震荡重悬磁珠，吸取100μl涂于细菌对应显色平板上，36℃培养24h～48h观察菌落并计数作为实验组，结果如表6所示。
表6免疫磁珠技术的敏感性试验
由表6可知，当单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌培养液在稀释度为10-8时，对照组已经无法检出目标菌，而试验组依然能检出目标菌，与对照组相比，检测结果高于对照组，敏感性高。