专利名称：生物环保发酵床养猪发酵菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种用于生物环保发酵床养猪的微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
人类养猪的历史已有2000多年，农业耕种模式的改变，为养猪由半放牧模式逐步转为圈养模式创造了条件；饲料工业的兴起，养殖技术的进一步发展，使养猪业走向了专业化、集约化、规模化的道路，猪的生长潜能得到了极大发挥；但是，高密度的工厂化饲养模式也带来了新的生态问题高剂量的抗生素、微量元素与重金属的添加，不仅破坏了动物体内的生态平衡，也恶化了外部养殖环境，严重影响了猪的正常发育和健康，猪发病率大大增加；集中排放的粪便与污水，污染了土壤和水源，造成了严重的养殖污染，给人类赖以生存的生态系统带来了极大的破坏。以养猪为例，一头约100公斤的出栏猪一生排泄量约为I. I吨，一头繁殖母猪一年排泄量约为4吨，我国年出栏猪约6亿头，存栏母猪4500万头，其中规模养殖约占42%，生猪年集中排泄量高达3. 2亿吨，这还不包括因冲洗猪舍导致超过10亿吨的污水以及3. 6亿多头散养猪的排泄物与污水。人们已经认识到，必须把经济发展与环境保护协调一致，建立可持续发展的健康生态系统；在这种背景下，各种有利于生态系统健康的高科技技术应运而生，生物环保(发酵床)养猪技术就是其中之一，生物环保(发酵床)养猪技术可以做到粪尿零排放，改善养殖环境，降低猪的疾病发生率，增进动物福利，提高效益，使养殖业更好地纳入农业生态循环体系，推动生态农业的循环发展。发酵床养猪垫料发酵分解粪尿的过程是微生物作用的结果，所以，发酵菌种活力的高低决定了粪便分解和垫料发酵的效率，是发酵床养猪法垫料制作的首要关键因素。目前，国内的同类产品多数是从自然界采集“土著菌”生产的不明微生物复合菌群，有的直接使用生物发酵肥菌种和EM菌液，微生物菌种的特性和作用发挥不确切，同时， 有的发酵剂使用操作复杂，实际升温速度较慢并且存在粪尿降解效果较差，容易造成死床; 有的菌种发酵床猪易患呼吸道和腹泻疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物环保发酵床养猪发酵菌剂。本发明的另一个目的是提供一种生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法。本发明生物环保发酵床养猪发酵菌剂，其组成和重量份配比为
羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496 I一2 份、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1923 2-5 份、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1866 2—4 份、嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282 2-3 份、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilissubsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108 2-4 份、阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314 1-3 份和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 3-5份，充分混匀后真空包装，即可得到复合菌剂。每一种发酵菌剂每毫升所含活菌数不小于IO9个。本发明生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，由以下步骤组成
I)菌种的培养
a.菌剂的活化
分别取体积百分含量为O. 9%生理盐水10ml，置于7个250ml三角瓶中，于121°C温度下灭活30分钟后冷却至30°C，在无菌状态下，将羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus) CGMCC NO. I. 1923、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophi lus) CGMCC NO. I. 1866、嗜热酸双歧杆菌 (Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108、阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4. 1314 和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 七株菌分别倒入上述7个装有生理盐水的250ml三角瓶中，震荡溶解后，在30°C恒温箱中静止30分钟，备用；
b.制备液体培养基
按各菌剂的培养基制备要求制备培养基各1000ml，备用；
c.一级菌剂的制备
分别各量取七株菌的培养基200ml，分别置于7个500ml三角瓶中，于121°C温度下灭活30分钟后冷却至30°C，接种步骤a中已活化的菌种，在30—35°C温度摇床(转速为150r/ min)上恒温培养48h，作为一级菌种发酵菌剂；
d.生产发酵菌剂的制备
首先配置7份生产发酵培养基，于121°C温度下湿热灭菌20分钟，自然冷却至30°C， 分别按5%的体积含量接种一级菌种，在30— 35°C温度摇床(转速为150r/min)上恒温培养 36—48h ;用紫外分光光度计检测7株生产菌剂在460nm处光密度(OD)值为X，后依据数学模型Y= (3. 14X+1. 42) X IO8估计每毫升菌液活菌含量；如生产发酵菌剂活菌数> IO9个/ ml，视同发酵成熟，如活菌数彡IO9个/ml，继续在40°C摇床上恒温培养，直到达到IO9个/ ml ；
e.粉剂冻干菌种的制备
将发酵成熟的生产发酵菌剂在无菌条件下倒入安培瓶(165X165)中，液面低于1cm， 加盖放入-30°C冰柜速冻，冻结后放入冻干机进行冷冻干燥。做为本发明的进一步改进，各菌种的培养基组成如下
嗜热脂肪芽孢杆菌培养基组成为蛋白胨10.0g，牛肉提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)3. Og,氯化钠5. Og,琼脂15. O,蒸馏水1000ml，pH值为7. O。嗜热酸双歧杆菌培养基组成为蛋白胨10.0，牛肉提取物10. 0g，酵母提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)5. Og,葡萄糖5. Og,磷酸氢二钾(K2HPO4) 0. 45g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0. 33g，氯化铵(NH4Cl) I. Og,七水硫酸镁(MgSO4.7H20) 0. Ig,体积百分含量为55%的L-半胱氨酸盐酸盐一水物(L-Cysteine. HCl H2O溶液)10. Oml,的体积百分含量为O. 1%树脂天青溶液(Resazurin溶液)I. 0ml，体积百分含量为5%的九水硫化钠溶液 10. Oml，蒸馏水 1000ml，pH 值为 7. 5。枯草芽孢杆菌培养基组成为牛肉提取物5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)5. Og,葡萄糖5. Og,氯化钠5. Og,琼脂15. Og,蒸馏水 1000ml, pH 值为 7. O。阿南德氏链霉菌培养基组成为酵母提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)
2.0g，可溶性淀粉10. 0g，琼脂15. 0g，蒸馏水1000ml，pH值为7. 3。酿酒酵母培养基组成为12波美度的麦芽汁1000ml，琼脂15. 0g，5波美度的麦芽汁IOOml与琼脂I. 5g的混合物；麦芽汁制备过程为称大米500g，洗净，加水4000ml，煮成米粥，冷却至60-65°C，将1500g麦芽粉掺入米粥中搅拌均匀，置于55-60°C保温箱内糖化4 小时，即可取出过滤，将滤液装瓶灭菌备用，用时将滤液稀释至所需糖。羊肚菌培养基组成为马铃薯提取液(南京泽朗农业发展有限公司)1000ml，葡萄糖20. Og,磷酸二氢钾(KH2PO4) 3. Og,七水硫酸镁(MgSO4. 7H20) I. 5g，维生素B1O. 5g，琼脂 15. 0g，pH 值为 6.0。做为本发明的更进一步改进，所述步骤d中生产发酵培养基组成为体积百分含量为10%的脱脂奶乳浊液，向每份脱脂乳浊液中加入液态甘油、低聚木糖、葡萄糖，液态甘油与脱脂奶乳浊液的体积比为2%，低聚木糖与脱脂奶乳浊液的质量体积比为2%、葡萄糖与脱脂奶乳浊液的质量体积比为2%。本发明发酵床垫料制作如下以玉米1.5 — 2%，稻壳(不粉碎28. 5— 30%)，锯末 40—50%,秸杆粉碎物20— 29%为发酵床垫料培养基，将本发明复合菌剂按15 — 20克/m2的比例，用40— 45°C温水2000ml溶解后，喷洒添加到垫料(培养基)表面，30cm厚度充分混匀，自然条件下3— 5天后发酵成熟。本发明复合菌剂均为非致病性菌，其中羊肚菌菌丝体中的氨基酸含量异常丰富， 并含有稀有氨基酸及香味物质，风味奇鲜，研究发现羊肚菌是有效的免疫调节剂，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤功能，真菌多糖并不能直接杀死肿瘤细胞，但却可以促进机体T细胞和NK细胞的活性，从而达到抑制肿瘤细胞增生的目的；酵母菌有益于维持猪肠道的健康； 链霉菌可以对发酵床内滋生的非优势菌起到抑制作用，利用维持优势菌群的稳定；而芽孢杆菌属的细菌由于芽孢保护，能耐受发酵高温，生长优势强，适合在发酵床中发挥优势作用，且发酵床中优势芽孢杆菌大多数能够分泌过氧化氢酶、脲酶、蛋白酶等酶类，利用猪粪迅速生长，除臭效果良好；在特定时期能够产生某些物质对大肠杆菌等有害菌的生长产生抑制作用，达到消纳粪便，抑制病原菌，促进猪生长的作用；发酵床中优势芽孢杆菌大部分对常用抗生素敏感，应用过程不会引入抗药性基因，并且由于其抑菌作用和免用抗生素，可以显著降低发酵床上饲养猪肠道抗药性及药物残留。使用本发明发酵菌剂制作的发酵床可以明显降低猪圈舍的臭味，减少蚊蝇滋生机会，提高猪的免疫力，保障猪能够健康成长，同时具有实践操作简单发酵床制作简单的特点。本发明的七株菌剂购买于中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；网址为http://WWW. cgmcc. net/， 点击菌种供应中的菌种目录,输入菌种编号即可购买。
图I是本发明菌种所制备的发酵床温度变化图。
具体实施例方式下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。菌种的选择
2号菌一羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496 ；
A 菌一枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. 1.108;
C 菌一嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. 1.1923;
D 菌一嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. 1.1866;
F菌一嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. 1.2282; H 菌一阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314;
N 菌一酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 本发明简称上述七株菌株为2号菌、A菌、C菌、D菌、F菌、H菌、N菌。菌株的培养基制备
2号菌一羊肚菌，培养基马铃薯提取液(南京泽朗农业发展有限公司)1000ml，葡萄糖20. Og,磷酸二氢钾(KH2PO4) 3. Og,七水硫酸镁(MgSO4. 7H20) I. 5g，维生素B1O. 5g，琼脂 15. 0g，pH 值为 6.0。A菌一枯草芽孢杆菌，牛肉提取物5. 0g，蛋白胨10. 0g，酵母提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)5. 0g，葡萄糖5. 0g，氯化钠5. 0g，琼脂15. 0g，蒸馏水1000ml，pH值为 7. O。C菌一嗜热脂肪芽孢杆菌，培养基蛋白胨10. 0g，牛肉提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)3. 0g，氯化钠5. 0g，琼脂15. 0，蒸馏水1000ml，pH值为7. O。D菌一嗜热脂肪芽孢杆菌，培养基蛋白胨10. 0g，牛肉提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)3. 0g，氯化钠5. 0g，琼脂15. 0，蒸馏水1000ml，pH值为7. O。F菌一嗜热酸双歧杆菌，培养基蛋白胨10.0，牛肉提取物10. 0g，酵母提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)5. Og,葡萄糖5. Og,磷酸氢二钾(K2HPO4) 0. 45g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0. 33g，氯化铵(NH4Cl) I. Og,七水硫酸镁(MgSO4.7H20) 0. Ig,体积百分含量为55%的L-半胱氨酸盐酸盐一水物(L-Cysteine. HCl H2O溶液)10. Oml,的体积百分含量为0. 1%树脂天青溶液(Resazurin溶液)I. 0ml，体积百分含量为5%的九水硫化钠溶液 10. Oml，蒸馏水 1000ml，pH 值为 7. 5。H菌一阿南德氏链霉菌，培养基酵母提取物(购买于上海沪宇生物科技有限公司)
2.0g，可溶性淀粉10. 0g，琼脂15. 0g，蒸馏水1000ml，pH值为7. 3 ；
N菌一酿酒酵母，培养基12波美度的麦芽汁1000ml，琼脂15. 0g，5波美度的麦芽汁 IOOml与琼脂I. 5g的混合物(注麦芽汁制备称大米500g，洗净，加水4000ml，煮成米粥， 冷却至60-65°C。将1500g麦芽粉掺入米粥中搅拌均匀，置于55-60°C保温箱内糖化4小时， 即可取出过滤，将滤液装瓶灭菌备用，用时将滤液稀释至所需糖)；
实施例Ia.菌剂的活化
分别取体积百分含量为O. 9%生理盐水10ml，置于7个250ml三角瓶中，于121°C温度下灭活30分钟后冷却至30°C，在无菌状态下，将七株菌种分别倒入上述7个装有生理盐水的250ml三角瓶中，震荡溶解后，在30°C恒温箱中静止30分钟，备用；
b.一级菌剂的制备
分别各量取七株菌的培养基200ml，分别置于7个500ml三角瓶中，于121 °C温度下灭活30分钟后冷却至30°C，接种步骤2中已活化的菌种，在30—35°C摇床(转速为150r/min) 上恒温培养48h，作为一级菌种发酵菌剂；
c.生产发酵菌剂的制备
首先配置7份10%的脱脂奶乳浊液(每份4000ml)，再向每份脱脂乳浊液中加入液态甘油80ml、低聚木糖80g、葡萄糖80g,于121/C温度下湿热灭菌20分钟，自然冷却至 30°C，分别按5%的体积含量接种一级菌种，在30— 35°C摇床(转速为150r/min)上恒温培养36— 48h ;用紫外分光光度计检测7株生产菌剂在460nm处OD值X，后依据数学模型 Y= (3. 14X+1. 42) X IO8估计每毫升菌液活菌含量。如生产发酵菌剂活菌数彡IO9个/ml，视同发酵成熟，如活菌数彡IO9个/ml，继续在40°C摇床上恒温培养，直到达到IO9个/ml ；
d.粉剂冻干菌种的制备
将发酵成熟的生产发酵菌剂在无菌条件下倒入安培瓶(165X165)中，液面低于1cm， 加盖放入_30°C冰柜速冻，冻结后放入冻干机进行冷冻干燥；
e.复合菌剂的制备
按粉剂冻干菌种重量，取羊肚菌粉末10g，嗜热脂肪芽孢杆菌I. 1923粉末20g，枯草芽孢杆菌粉末20g份，嗜热脂肪芽孢杆菌I. 1866粉末20g，阿南德氏链霉菌粉末10g，嗜热酸双歧杆菌粉末20g，酿酒酵母2. 2081粉末30g，充分混匀后真空包装，即可得到复合菌剂；
7.发酵床垫料制作
以玉米I %，稻壳30 % (不粉碎)，锯末40%，秸杆粉碎物29 %为发酵床垫料(培养基)， 将本发明复合菌剂按15克/m2的比例，用40°C温水2000ml溶解后，喷洒添加到垫料(培养基)表面，30cm厚度充分混勻，自然条件下3—5天后发酵成熟。实施例2
与实施例I不同处在于复合菌剂的制备及发酵床垫料制作，
复合菌剂的制备按粉剂冻干菌种重量，取羊肚菌粉末20g，嗜热脂肪芽孢杆菌I. 1923 粉末50g，枯草芽孢杆菌粉末40g，嗜热脂肪芽孢杆菌I. 1866粉末40g份，阿南德氏链霉菌粉末30g份，嗜热酸双歧杆菌粉末30g份，酿酒酵母2. 2081粉末50g份，充分混匀后真空包装，即可得到复合菌剂。发酵床垫料制作
以玉米I. 5 %，稻壳28. 5 % (不粉碎)，锯末50%，秸杆粉碎物20 %为发酵床垫料(培养基)，将本发明复合菌剂按20克/m2的比例，用45°C温水2000ml溶解后，喷洒添加到垫料 (培养基)表面，30cm厚度充分混勻，自然条件下3—5天后发酵成熟。应用效果
一、发酵床温度测定
试验设对照组、试验I组和试验2组，对照组发酵床垫料接种市场上购买的益康发酵床专用益生菌剂(主要成分芽孢杆菌，放线菌、光合菌等)(按使用说明量每100公斤垫料添加50g)，试验I组为实施例I生产的复合菌剂(复合菌剂按每100公斤垫料添加15克的比例)。试验2组为实施例I生产的复合菌剂(复合菌剂按每100公斤垫料添加20克的比例)。分别选择体重20kg左右健康无病的杜长大三元杂交保育猪60头，随机分为3组 (对照组和试验组)，每组20头。对照组和试验组基础日粮相同。试验分别在第I一 14天每天取表层20cm处样品，为提高试验数据的可比性，每次样品均在同一区域采取。取样的同时，对垫料表层人工翻堆混匀。分析检测样品温度和含水量变化。通过图I所示可以看出，试验组和对照组垫料温度变化趋势一致，都是先增长后下降，最后趋于稳定。环境气温变化对发酵床温度变化的影响不大。在14天测试期， 试验I组垫料温度(43. 74°C)和试验2组垫料温度(45. 19°C )分别高于对照组垫料温度(33. 590C ) 10. 16°C和11. 60°C，试验I组、试验2组垫料温度均极显著高于对照组(P
<O. 01);试验2组垫料温度高于试验I组垫料温度，但差异不显著(P > O. 05)。三组垫料温度均在第5d时达到峰值，分别为35. 90C >50. 2和54. 7. 6°C，随后呈现下降，I Id后基本趋于稳定。试验结果表明，以本次筛选的发酵床复合菌种对猪舍内发酵床温度提升效果优与 “益康发酵床专用益生菌”。二、发酵床育肥猪饲养效果试验
选择断奶仔猪90头，体重20kg，分为3组，每组30头，对照组饲养在传统水泥地面； 试验I组饲养在由本项目复合菌种制备的成熟发酵床上；试验2组饲养在由“益康发酵床专用益生菌”制备的成熟发酵床上；同时保持三组圈舍的其他条件相同；试验期102天。试验测定1)记录试验正式开始和结束体重、耗料量；2)每天8 30和15 30记录猪舍内温度与相对湿度，每周二 9 00对猪舍内空气采样，测定氨气浓度和悬浮颗粒浓度； 3)试验期记录验收猪腹泻和发病情况，试验结束前一天，每组随即抽取5头猪空腹耳静脉采血，测定血清免疫指标一免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgA、免疫球蛋白IgM。图I是本发明菌种所制备的发酵床温度变化图。育肥猪生产性能测定见表1，冬季水泥地面猪舍及发酵床猪舍育肥猪血清免疫指标测定见表2，冬季水泥地面猪舍及发酵床猪舍育肥猪发病情况见表3。试验结果显示在冬季，生物环保(发酵床)养猪和我国传统水泥地面养猪技术相比存在以下优势
I)取暖效果好。图I说明冬季(2010年10月 2012年2月)，发酵床舍内平均温度高于水泥地面舍3. 4°C以上，整个饲养期内，发酵床舍内平均温度为16. 62°C，极显著高于水泥舍内的13.22°C (P〈0.01)。试验地(武威市凉州区)冬季寒冷，一般最冷时间为每年的 I 2月份，最低温度可达-18 -21°C左右。生物环保(发酵床)猪舍温度更适宜猪的生长。试验过程中测量的猪舍温度为猪背部等高的环境温度，该温度远远低于发酵床表面温度。试验测定表示，发酵床表面温度一般维持在24°C 26°C，此温度远远高于水泥舍水泥地面的表面温度10 14°C。2)生物环保(发酵床)猪舍内空气质量得到改善。猪在发酵床垫料上生长，猪排泄的粪污被垫料中的微生物分解，猪舍基本无臭气。而本试验中尽管水泥地面舍采用干清粪方式，生物环保(发酵床)猪舍中的氨气和悬浮颗粒浓度仍极显著低于水泥地面舍(P<O. 01)，表明猪舍内环境得到改善，我国农产品安全质量无公害产地环境要求猪舍中氨气的浓度彡25mg/m3，悬浮颗粒浓度彡3mg/m3。生物环保(发酵床)猪舍内环境达到了国家标准。3)猪福利明显改善。表I说明发酵床垫料核心温度保持在40°C以上，垫料表面温度一般为24V 26°C,而水泥舍地表温度为10 14°C。发酵床表面铺垫锯末、稻壳和秸杆，水泥舍地面为水泥，水泥面保暖性能差，散热快，猪在水泥地面上趴卧，猪维持净能相对增加，生产净能相对减少，生物环保(发酵床)猪舍比水泥床猪舍日增重提高113g(100头猪，平均日增重813g/日)，提高16. 71% ;料重比2. 94，比水泥床降低5. 5%(水泥床日增重 700g，料重比3. 31)。试验中观察到猪从进栏到出栏整个饲养过程中，生物环保(发酵床)猪舍猪扎堆次数明显少于水泥地面猪舍，表明发酵床舍猪福利程度明显改善。4)表2、表3表明说明本试验中生物环保(发酵床)猪舍猪IgA、IgG浓度显著高于水泥地面猪舍(p〈0. 05)。这与发酵床舍猪患病几率低的报道相一致。尽管猪饲料中已添加抗生素，水泥地面猪舍猪仍存在气喘等呼吸道疾病症状，而发酵床舍中未观察到该现象。
表I育肥猪生产性能测定
权利要求
1.一种生物环保发酵床养猪发酵菌剂，其特征在于其组成和重量份配比为羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496 I一2 份、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1923 2-5 份、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1866 2—4 份、嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282 2-3 份、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108 2-4份、阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314 1-3 份和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 3-5份，每一种发酵菌剂每毫升所含活菌数不小于IO9个。
2.权利要求I所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于该方法由以下步骤组成O菌种的培养a.菌剂的活化取羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5. 496、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) CGMCC NO. 1.1923、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophiIus) CGMCC NO. I. 1866、嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108、阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4. 1314 和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 七株菌活化；b.制备液体培养基制备培养基各1000ml，备用；c.一级菌剂的制备分别各量取七株菌的培养基200ml，分别置于7个500ml三角瓶中，于121 °C温度下灭活30分钟后冷却至30°C，接种步骤a中已活化的菌种，在30— 35°C温度摇床上恒温培养 48h，作为一级菌种发酵菌剂；d.生产发酵菌剂的制备首先配置7份生产发酵培养基，在于121°C温度下湿热灭菌20分钟，自然冷却至30°C， 分别按5%的体积含量接种一级菌种,在30—35°C温度摇床上恒温培养36—48h,使每一种发酵菌剂每毫升所含活菌数不小于IO9个；e.粉剂冻干菌种的制备将发酵成熟的生产发酵菌剂在无菌条件下倒入安培瓶中，加盖放入冰柜速冻，冻结后放入冻干机进行冷冻干燥；2)按粉剂冻干菌种重量，取羊肚菌(Morchella sp. ) CGMCC NO. 5.496 I— 2份、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. I. 1923 2-5 份、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophi lus ) CGMCC NO. I. 1866 2一4 份、嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermoacidophilum) CGMCC NO. I. 2282 2-3 份、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp. subtilis) CGMCC NO. I. 108 2-4 份、阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii) CGMCC NO. 4.1314 1-3 份和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC NO. 2. 2081 3-5份，充分混匀后真空包装，即可得到复合菌剂。
3.根据权利要求2所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于步骤a.菌剂的活化过程为分别取体积百分含量为O. 9%生理盐水10ml，置于7个250ml三角瓶中，于121°C温度下灭活30分钟后，冷却至30°C，在无菌状态下，将七株菌种分别倒入7个装有生理盐水的三角瓶中，震荡溶解后，在30°C恒温箱中静止30分钟。
4.根据权利要求3所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤b液体培养基中的嗜热脂肪芽孢杆菌培养基组成为蛋白胨10. 0g，牛肉提取物3. 0g，氯化钠5. 0g，琼脂15. 0，蒸馏水1000ml，pH值为7. O。
5.根据权利要求3所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤b液体培养基中的嗜热酸双歧杆菌培养基组成为蛋白胨10. 0，牛肉提取物10.Og,酵母提取物5. Og,葡萄糖5. Og,磷酸氢二钾O. 45g,磷酸二氢钾O. 33g,氯化铵I. Og, 七水硫酸镁O. Ig,体积百分含量为55%的L-半胱氨酸盐酸盐一水物10. Oml,的体积百分含量为O. 1%树脂天青溶液I. 0ml，体积百分含量为5%的九水硫化钠溶液10. 0ml，蒸馏水 1000ml, pH 值为 7. 5。
6.根据权利要求3所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤b液体培养基中的枯草芽孢杆菌培养基组成为牛肉提取物5. Og,蛋白胨10.Og,酵母提取物5. Og,葡萄糖5. Og,氯化钠5. Og,琼脂15. Og,蒸馏水1000ml，pH值为7.O。
7.根据权利要求3所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤b液体培养基中的阿南德氏链霉菌培养基组成为酵母提取物2. 0g，可溶性淀粉10. 0g，琼脂15. 0g，蒸馏水1000ml，pH值为7. 3。
8.根据权利要求3所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤b液体培养基中的酿酒酵母培养基组成为12波美度的麦芽汁1000ml、琼脂15.0g、5波美度的麦芽汁IOOml与琼脂I. 5g组成的混合物。
9.根据权利要求3所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤b液体培养基中的羊肚菌培养基组成为马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20.Og,磷酸二氢钾3. Og,七水硫酸镁I. 5g，维生素B1O. 5g，琼脂15. 0g, pH值为6. O。
10.根据权利要求4-9所述的生物环保发酵床养猪发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤d中生产发酵培养基组成为体积百分含量为10%的脱脂奶乳浊液，再向每份脱脂乳浊液中加入液态甘油、低聚木糖、葡萄糖，液态甘油与脱脂奶乳浊液的体积比为2%， 低聚木糖与脱脂奶乳浊液的质量体积比为2%、葡萄糖与脱脂奶乳浊液的质量体积比为2%。
全文摘要
本发明公开了一种生物环保发酵床养猪发酵菌剂及其制备方法，首先选择羊肚菌(Morchella sp.)CGMCC NO.5.496，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) CGMCC NO.1.1923，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)CGMCC NO.1.1866，嗜热酸双歧杆菌(Bifidobacterium thermoacidophilum)CGMCC NO.1.2282，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis)CGMCC NO.1.108，阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii)CGMCC NO.4.1314，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC NO.2.2081七株菌为生产发酵母剂，各生产发酵母剂活菌数≥108个/ml，然后对7株生产发酵菌剂进行冻干，按粉剂冻干菌种重量，充分混匀后真空包装，即可得到复合菌剂。使用本发明发酵菌剂制作的发酵床可以明显降低猪圈舍的臭味，减少蚊蝇滋生机会，提高猪的免疫力，保障猪能够健康成长，同时具有实践操作简单发酵床制作简单的特点。
文档编号C12R1/125GK102577985SQ20121004490
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者徐庚全, 王成泰, 王明奎, 谢占玲, 雷华 申请人:武威市金绿源农业科技发展有限公司