从胎盘中分离间充质干细胞的方法

专利名称：从胎盘中分离间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及从胎盘中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的ー类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan Al. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res. 1991,9 :641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999 ;284 :143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历ー个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每IO5 IO6个单个核细胞中大约只有I个，而且随着年龄的增加，骨髄中间充质干细胞的数量、増殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟ー个崭新而丰富的来源。现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267. 6，
公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN 101693884A(中国专利申请号200910117522. 9，
公开日2010年4月14日)公开的题为“ー种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN 102146359A(中国专利申请号201110005964. 1，
公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进ー步改善的。
本领域仍然需要有新的从胎盘中分离干细胞的方法，特别是从胎盘中分离间充质干细胞的方法。

发明内容
本发明的目的是解决现有获取胎盘间充质干细胞方法的缺陷，提供ー种实用简单的从胎盘中大量分离间充质干细胞并任选地建立胎盘干细胞库的方法。本发明人发现采用特别的操作方法，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高。本发明基于此发现而得以完成。因此，本发明第一方面提供了从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消 化酶的PBS缓冲液，再在37°C孵育消化；(C)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37°C、5% CO2培养箱中培养；(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞；以及任选的下列一个或多个步骤(f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少ー项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；(h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联。根据本发明第一方面的方法，其中所述步骤(a)是在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘中残留的血液。根据本发明第一方面的方法，其中所述步骤(a)是在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。根据本发明第一方面的方法，其中所述步骤(b)中的组织消化酶是选自下列的一种或多种dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I (DNase I)、胶原酶IV、透明质酸酶。在ー个实施方案中，所述步骤(b)中的组织消化酶包括dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I (DNaseI)、胶原酶IV、透明质酸酶。在一个实施方案中，在步骤(b)中，所述PBS缓冲液中包含约O. lmg/mLdispase、约 O. 25mg/mL 膜酶、约 O. 25mg/mL DNase I、约 lmg/mL 胶原酶 IV、和约lmg/mL透明质酸酶。根据本发明第一方面的方法，在步骤(b)中，在37°C孵育10 30分钟，优选10 20分钟，例如10分钟、15分钟或20分钟。根据本发明第一方面的方法，在步骤(b)中，将胎盘小叶剪成约Icm3大小的组织块。根据本发明第一方面的方法，在步骤(C)中，将组织块用铜网过滤同时用注射器研磨。在一个实施方案中，在步骤(c)中，将组织块和细胞悬液一起用160 240目(优选200目)铜网过滤同时用注射器活塞研磨组织块。
根据本发明第一方面的方法，在步骤(d)中，所述MSC培养基是含10% FBS的PBS缓冲液。在本发明的任一方面的一个实施方案中，所述MSC培养基是含10% FBS的PBS缓冲液。在一个实施方案中，在步骤(d)中，将收集的过滤液用密度梯度离心法分离单个核细胞，洗涤，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37°C、5% CO2培养箱中培养。在ー个实施方案中，在步骤(d)中，将收集过滤后的细胞悬液加入到离心管中，IOOOrpm离心10分钟，倒掉上清，用含10% FBS的PBS缓冲液重悬细胞。根据本发明第一方面的方法，在步骤(e)中，待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞60 90%融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。在一个实施方案中，在步骤(e)中，当散在贴壁细胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，传代培养。
根据本发明第一方面的方法，在步骤(f)中，所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。根据本发明第一方面的方法，在步骤(f)中，所述细胞污染检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的ー项或多项的感染こ肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM和 EBV-IgA、TRUST。根据本发明第一方面的方法，在步骤(f)中，所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。根据本发明第一方面的方法，在步骤(f)中，所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR 表型。根据本发明第一方面的方法，在步骤(g)中，所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。根据本发明第一方面的方法，在步骤(g)中，所述胎盘间充质干细胞存在于细胞冻存液中。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含50%低糖DMEM培养液、40% FBS、10%ニ甲基亚讽。根据本发明第一方面的方法，在步骤(h)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限干细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘中残留的血液。再将胎盘小叶剪成Icm3大小的组织块，加入含有多种组织消化酶的的PBS缓冲液在37°C孵育15分钟，将组织块用铜网过滤同时用注射器研磨。收集过滤后的液体用密度梯度离心法分离单个核细胞，洗涤后用MSC培养基悬浮所获得的细胞放到37°C 5% CO2培养箱中培养。待散在细胞形成克隆后，将各克隆细胞挑出用MSC培养基分别培养，细胞80 90 %融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤产后四小时之内在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积FBS的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。先将胎盘小叶剪成Icm3大小的组织块,加入到含有O. lmg/mL dispase、0. 25mg/mL胰酶、O. 25mg/mL DNase I、lmg/mL胶原酶IV、lmg/mL透明质酸酶的PBS缓冲液中37°C消化15分钟，加入适量FBS終止消化。再将组织块和细胞悬液一起用200目铜网过滤同时用注射器活塞研磨组织块，收集过滤后的细胞悬液加入到离心管中IOOOrpm离心10分钟，倒掉上清，用含10% FBS的PBS缓冲液重悬细胞。然后用密度梯度离心法分离收集单个核细胞，PBS缓冲液洗涤单个核细胞后用MSC培养基悬浮所获得的细胞，接种单个核细胞的密度 为每75cm2 (细胞培养瓶内表面积)I X IO7单个核细胞共IOml MSC培养基。最后将培养瓶放到37°C 5% CO2培养箱中培养。72小时后全量换液去除非贴壁细胞，培养瓶中会有散在的梭型贴壁细胞，加入新鲜MSC培养液继续培养。10天左右，散在贴壁细胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，细胞计数后，按照3000细胞/cm2进行传代培养；之后，当细胞达到70%左右融合时消化传代培养，即得胎盘间充质干细胞。此外，在本发明第一方面方法中，提供了一种胎盘间充质干细胞。因此本发明第二方面提供了一种胎盘间充质干细胞。根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其细胞纯度大于95%。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经3代以上传代后，细胞纯度大于95%。下面对本发明作进ー步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过弓I用并入本文。在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互換使用，除非另有明确指明。在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围。在本发明中，术语“胎盘”是指新生儿胎盘，特别是指产后4小时之内的胎盘。在本发明中，术语“MSC培养基”是指间充质干细胞培养的专用培养基。本发明的发明人曾利用灌流法从胎盘中分离培养间充质干细胞，获得了纯度很高的间充质干细胞。但是经过灌流后仍然会有大量干细胞滞留在胎盘组织中，不能有效地被分离出来。因此可以认为，采用灌流法不能最大限度的得到间充质干细胞。本发明公开了ー种从胎盘中大量分离间充质干细胞的方法，并利用这种方法保存胎盘间充质干细胞并建立胎盘干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用多种组织消化酶混合消化胎盘小叶组织块，结合贴壁培养法，成功自胎盘中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与 骨髄间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于胎盘中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立胎盘干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样胎盘间充质干细胞作为ー种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立胎盘干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。本发明的目的是提供一种实用简单的从胎盘中大量分离间充质干细胞并建立胎盘干细胞库的方法，包括如下步骤在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘中残留的血液。再将胎盘小叶剪成Icm3 大小的组织块，加入含有多种组织消化酶的的PBS缓冲液在37°C孵育15分钟，将组织块用铜网过滤同时用注射器研磨。收集过滤后的液体用密度梯度离心法分离单个核细胞，洗涤后用MSC培养基悬浮所获得的细胞放到37°C 5% CO2培养箱中培养。待散在细胞形成克隆后，将各克隆细胞挑出用MSC培养基分别培养，细胞80 90%融合后，用胰酶消化传代，将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。根据本发明的方法，例如根据本发明实施例1、2的方法，ー个重量为750克的胎盘可以分得8 X IO9单个核细胞，经过贴壁培养平均I X IO6单个核细胞中可以获得12个克隆，鉴定后平均有3个克隆具有间充质干细胞的特性，即750g胎盘中可分得24000个间充质干细胞。这些干细胞经过体外短期培养可以很快达到细胞生物学实验以及临床治疗所需数量。然而，本发明人发现，按照CN1548529A中实施例一的方法，ー个重量为750克的胎盘大约可分离得到3000个间充质干细胞，经3代传代后，细胞纯度大于约为95%。在本发明ー个实施方案中，在步骤(b)中所述PBS缓冲液中包含约O. lmg/mL dispase、约O. 25mg/mL胰酶、约O. 25mg/mL DNase I、约lmg/mL胶原酶IV、和约lmg/mL透明质酸酶；本发明人发现该PBS缓冲液中的5种酶，缺少任一种或多种时，间充质干细胞收率和细胞纯度均远远达不到上述750g胎盘中可分得24000个间充质干细胞的结果；此外，5种酶的浓度作适当变化，特别是在低于上述各自浓度的50%或者高于上述各自浓度的200%吋，间充质干细胞收率和细胞纯度均明显比上述750g胎盘中可分得24000个间充质干细胞的结果差；例如当PBS缓冲液中的dispase浓度为O. 04mg/mL (低于本发明上述浓度的50% )或者为O. 25mg/mL (高于本发明上述浓度的200% )吋，750g胎盘中约可分得8000个间充质干细胞且细胞低度低于90%。因此，本发明的一个实施方案是在步骤(b)中，所述PBS缓冲液中包含O. 05 O. 2mg/mL dispase、。· 125 O. 5mg/mL 膜酶、O. 125 O. 5mg/mL DNase I、O. 5 2mg/mL 胶原酶IV、和O. 5 2mg/mL透明质酸酶。本发明操作简单，方便实用，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离胎盘，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自胎盘中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立胎盘干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一祥，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。


图I为显微镜下对细胞生长的形态学观察。其中A为培养3天后可见散在的贴壁细胞；B为7 10天形成克隆；C为经筛选克隆形成致密贴壁细胞；D、E、F为瑞氏姬姆萨染色。图2为流式细胞术鉴定MSC表面标志结果。各图中纵坐标“counts”表示计数量。图3为胎盘MSC细胞周期的分析結果。其中，P3为培养第三代细胞的DNA含量，分析细胞周期，可见大部分细胞处于静止期(GノG1期 ，96. 66%)，极少细胞处于増殖期(S期，3. 25% )0 P6为培养第六代的细胞的DNA含量，分析细胞周期，可见大部分细胞处于静止期(GcZG1期，96. 35% )，极少细胞处于増殖期(S期，2. 54% )。各图中纵坐标“counts”表示计数量，横坐标标“DNA Content”表示DNA含量。图4为胎盘MSC细胞生长曲线图。图5为胎盘MSC多向分化潜能鉴定的成骨诱导细胞图。图6为胎盘MSC多向分化潜能鉴定的成脂肪诱导细胞图。图7为胎盘MSC多向分化潜能鉴定的成软骨诱导细胞图。图8为RT-PCR检测胎盘MSC多向分化潜能的电泳照片。
具体实施例方式通过下面的实施例可以对本发明进行进ー步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。实施例I、胎盘MSC的分离在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积FBS的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。先将胎盘小叶剪成Icm3大小的组织块，加入到含有 O. lmg/mL dispase、0. 25mg/mL 膜酶、O. 25mg/mL DNase I、lmg/mL 胶原酶 IV、lmg/mL透明质酸酶的PBS缓冲液中37°C消化15分钟，加入适量FBS终止消化。再将组织块和细胞悬液一起用200目铜网过滤同时用注射器活塞研磨组织块，收集过滤后的细胞悬液加入到离心管中IOOOrpm离心10分钟，倒掉上清，用含10% FBS的PBS缓冲液重悬细胞。然后用密度梯度离心法分离收集单个核细胞，PBS缓冲液洗涤单个核细胞后用MSC培养基悬浮所获得的细胞，接种单个核细胞的密度为每75cm2(细胞培养瓶内表面积)IX IO7单个核细胞共IOml MSC培养基。最后将培养瓶放到37°C 5% CO2培养箱中培养。72小时后全量换液，去除非贴壁细胞，培养瓶中会有散在的梭型贴壁细胞，再加入新鲜MSC培养液继续培养。
_0] 实施例2、胎盘MSC的传代培养及其冻存在约10天后，待散在贴壁细胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mMEDTA消化，细胞计数后，按照3000细胞/cm2进行传代培养。之后，当细胞达到70%左右融合时消化传代培养。消化后取3 X IO6细胞加入到Iml细胞冻存液(含50%低糖DMEM培养液、40% FBS、10%ニ甲基亚砜)中，经过程序降温最后进入到液氮管中冻存。实施例3、胎盘MSC的生物学特性鉴定I、细胞生长及其形态学特点 通过实施例I和实施例2的分离培养，胎盘单个核细胞培养72小时后在显微镜下可明显见到梭形贴壁细胞(图1A)，10天左右会形成涡轮状细胞克隆(图1B、图1D)，消化传代后会形成80%左右融合的贴壁层(图1C、图1E、图1F)。培养过程中，发现这种细胞形态相对均一，増殖速度快，贴壁速度快，易被胰酶消化，传代至15代以上，其形态及生长特点亦无明显改变。2、流式细朐术鉴定MSC表面标志分别取第3、6、9、12、15代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，动态观察培养过程中细胞表面标志的变化。消化收集细胞，计数后取8X IO6个细胞，分装16管；PBS洗一次，1500rpm离心IOmin ;弃上清，残留100 200 μ 1，吹打混匀细胞；加入PE标记的⑶14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗体以及 FITC 标记的 CD45、CD105、HLA-ABC, HLA-DR、UEA-I抗体各10 μ 1，并设一管为空白对照；在4°C下，避光反应30min ；PBS洗一次，1500rpm离心IOmin ;直接标记的细胞弃上清，加入200 μ I PBS吹打混匀细胞，200 μ I的1%多聚甲醛固定，置4°C待測，3天内上流式细胞仪检测。流式细胞仪检测细胞的表面标志，动态观察第3、6、9、12、15代的细胞，无明显改变。不表达造血细胞表面标志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及内皮细胞阳性)、⑶45 (白细胞阳性)、CD54 (ICAM-I)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC-II 类分子)持续阴性，CD29 和⑶44 (纤维蛋白和透明脂酸盐的受体，基质细胞表达)、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、CD166 (间充质细胞表达)、HLA-ABC (MHC-I类分子)和UEA-I (内皮细胞的表面标志)持续为阳性。经3代以上传代后，细胞成分均一，纯度在95%以上。(图2)3、流式细胞术检测胎盘MSC的细胞周期细胞长至80%左右融合时，消化收集细胞约I X IO6个，PBS洗一次，加入70%的こ醇固定，4°C待测。检测时，先离心去こ醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反应30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，终浓度50 μ g/ml) 1ml，室温避光反应20min，上机检
测细胞DNA含量。经测定第3代和第6代细胞的DNA含量，细胞周期分析，G0ZG1期、S期和G2M期所占比例分别为96. 35%,96. 66%, I. 11%>0. 09%，和2. 54%,3. 25%。结果表明体外培养的细胞具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的増殖期(I. 11%>0. 09% ),大部分的细胞处于静息期(96. 35%>96. 66% ) ο (图3)4、胎盘MSC牛长曲线的绘制及对数牛长期倍增时间的测定取对数生长期细胞，消化计数，以10% FBS的LG-DMEM培养基制成细胞悬液(2 X 104/ml), 24孔板中每孔接种O. 5ml,37°C,5% CO2，饱和湿度下培养。每天取3复孔，台盼蓝染色后计数活细胞数，计算平均值，连续观察7天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间，即Td = Tlg2/ Lg(Nt/No)，Td :倍增时间(h)，T :细胞由No增至Nt所用的时间(h)，N :细胞数。
通过每天细胞计数的结果绘制细胞生长曲线，计算倍増时间。由细胞生长曲线可以看出，细胞在第2-4天处于指数生长期。根据公式计算出第5代细胞在指数生长期的倍增时间分别为22. 6h。(图4)5、胎盘MSC多向分化潜能的鉴定(I)成骨诱导3代以上MSC，按1父105/孔接种六孔板，放于37で、5% CO2、饱和湿度下，MSC培养基中培养24h后，换用含10%经筛选FBS的DMEM-HG并加入地塞米松O. I μ Μ、抗坏血酸磷酸盐50 μ Μ、β-磷酸甘油10mM，放于37°C、5% CO2、在饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2-4周。碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。
在含10%经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松O. I μ Μ、抗坏血酸磷酸盐50 μ Μ、β -磷酸甘油IOmM培养I周，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形的成纤维细胞样变为多角形，类似于神经元细胞样，细胞周边出现长丝状突出，并可向周围延伸。继续培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，至培养4周后，可见明显钙化结节。2周时碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，达到95%以上，而未加以诱导的对照组则大部分为阴性，只有不到5%显示为弱阳性，表明细胞已向成骨细胞转化。vonKossa染色可将骨结节中沉积的钙染成黑色，诱导组可见大量的黒色骨结节，有明显的立体结构，而对照组在任何时间都没有阳性反应。(图5)(2)成脂肪i秀导3代以上MSC，按1父105/孔接种于六孔板，放于37で、5% CO2、饱和湿度下，在MSC培养基中培养24h后，换用含10%经筛选FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松I μ Μ、消炎痛60 μ M、IBMX O. 5mM、胰岛素5μ g/ml，放于37°C，5% CO2，饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2周，油红染色鉴定脂滴形成。在含10 %经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松I μ Μ、消炎痛200 μ M、IBMXO. 5mM、胰岛素10 μ g/ml培养3天，细胞即发生形态改变，由纺锤形的成纤维细胞样逐渐收缩变短，90%以上细胞成为立方形或多角形；连续培养7天，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大并融合，至培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞。油红O染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。(图6)(3)成软骨诱导3代以上细胞，按照每管2X IO5细胞分装到15ml聚丙烯离心管，低速离心使细胞在试管中形成微团，在含2. 5% FBS的DMEM-HG中加入胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠各6. 25 μ g/ml, BSA I. 25 μ g/ml,丙丽酸纳 ImM/L,抗坏血酸憐酸 37. 5 μ g/ml, TGF- β pOng/ml，放于37°C、5% CO2、饱和湿度下培养，每3天半量换液，连续培养2周。诱导2周后将细胞微团打散涂片，阿辛蓝(Alcian blue)染色可见II型胶原形成细胞外基质呈蓝色，对照组无藍染。(图7)6、RT-PCR检测胎盘MSC多向分化潜能收集诱导后的细胞，应用Trizol试剂提取细胞总RNA，以之为模板进行RT-PCR，反转录以及PCR操作按照RT-PCR试剂盒说明书进行，引物序列如表I所示。表I. RT-PCR引物序列及其特异性名称引物序列(5’-3，)PCR产物大小特异性
骨桥蛋白上游TGAGCTTTCTTACATTCCACC169bp成骨细胞特异
(Osteopontin)下游CTTACTTGGAAGGGTCTCT性胞外基质
PPAR-Y2上游TGTCAGTACTGTCGGTTTC241bp脂肪细胞特异
下游AATGGTGATTTGTCTGTTG性转录因子
肢原II上游AGTGGAGACTACTGGATTGA394bp软骨细胞特异
(Collagen II)下游AGTGTACGTGAACCTGCTAT性胞外基质
ガ2-微球蛋白上游CTCGCGCTACTCrCrCrCTCnTCrGG335bpPCR内部参考
{fl2-Microglobulin)下游GCTTACATGTCrCGATCCCACITAA图8中，从左至右分别为胎盘MSC细胞、诱导成为脂肪细胞、诱导为成骨细胞、诱导为软骨细胞的RT-PCR电泳照片，其中从左至右，Normal泳道为诱导前细胞基因表达情况，Adipogenic泳道、Osteogenic泳道、Chondrogenic泳道为诱导后细胞基因表达情况。结果表明，体外诱导后细胞能表达系列特异性mRNA :成脂肪诱导后细胞表达PPAR-Y，成骨诱导后细胞表达骨桥蛋白(Osteopontin)，成软骨诱导后细胞表达胶原II (Collagen II)，说明所得到的MSC细胞具有成骨、成脂肪、成软骨分化能力，符合公认的MSC标准。通过以上一系列数据指标的检测，显示出应用本发明方法分离得到的MSC，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的MSC具有干细胞特性。实施例4、胎盘干细胞库的津立I、细胞活件的检测利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。2、细胞污染的检测利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到こ肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb,HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST 感染。3、遗传病的检测 利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。4、HLA-ABC/DR 配型检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。5、细胞来源的调杳记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。6、胎盘干细胞数据库的津立在保存正常的胎盘干细胞后，建立胎盘干细胞的数据库，其中包括前六项资料，并建立与冻存细胞的关联。
权利要求
1.从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤 (a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液； (b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37°C孵育消化； (c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤； (d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37°C、5% CO2培养箱中培养； (e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞； 以及任选的下列一个或多个步骤 (f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型； (g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存； (h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联。
2.根据权利要求I的方法，其中所述步骤(a)是在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。
3.根据权利要求I的方法，其中所述步骤(b)中的组织消化酶是选自下列的一种或多种dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I (DNase I)、胶原酶IV、透明质酸酶。
4.根据权利要求I的方法，在步骤(b)中，在37°C孵育10 30分钟，优选10 20分钟，例如10分钟、15分钟或20分钟。
5.根据权利要求I的方法，在步骤(d)中，所述MSC培养基是含10%FBS的PBS缓冲液。
6.根据权利要求I的方法，在步骤(e)中，待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞60 90%融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。
7.根据权利要求I的方法，在步骤(f)中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb, HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST。
8.根据权利要求I的方法，在步骤(h)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。
9.根据权利要求I至9任一项的方法，其中所获得的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于 95 %。
10.一种胎盘间充质干细胞，其是根据权利要求1-9任一项的方法获得的。
全文摘要
本发明涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法。所述方法包括(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养；(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。通过本发明方法可以获得高纯度的胎盘间充质干细胞。
文档编号C12N5/0735GK102676451SQ201210044648
公开日2012年9月19日 申请日期2012年2月27日 优先权日2011年9月5日
发明者张毅, 李诣书, 许晓椿, 陈俊峯, 霍思维 申请人:博雅干细胞科技有限公司