专利名称：一种前t载体、t载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域一种质粒载体及其构建方法，特别涉及一种T载体及其制备方法。
背景技术：
克隆(Clone)是指一个共同前体通过无性繁殖而形成的一群基因结构相同的细胞或个体。对于基因克隆，则指一个基因反复扩增后产生的多个拷贝。亚克隆(Subclone) 是指用限制性酶切或PCR等手段从已经克隆的DNA中获得该克隆DNA的部分序列或改造过的序列，再克隆到另外的新载体中的技术。PCR(Polymerase Chain Reaction),是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，实验室应用最为广泛常用的Taq DNA聚合酶不仅具有 5' -3'延伸引物的聚合酶活性，还具有非模板依赖型末端转移酶活性，用该酶进行PCR反应后，所产生的片段3，末端大部分突出一个A碱基，将突出末端A碱基消除进行平端连接不仅效率极低而且较为繁琐。T-A克隆是把PCR片断与一个具有3' -T突出的载体DNA连接起来的方法。因为 PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A，例如，Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3' -A突出端。只有用经过特殊处理的具有3' -T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。T载体(T-Vector)就是其3'末端带有突出的T碱基，是可直接与PCR扩增产物3'末端突的A碱基配对的线性载体。现在市场上主流的制备T载体的方案一般有以下几种一种先利用平端内切酶将环状质粒酶切成平末端的线性载体，再利用核酸末端转移酶，以dTTP为底物在两个3， 末端各力口上一个 T (Holton, T. A. and Graham, M. ff. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors (一种利用 ddT 突出端载体直接克隆PCR产物的简便有效的方法).Nucleic Acids Res. 1991，19，1156)。另一种方法是先制备一种前T载体，再利用特殊的XamI限制性内切酶酶切，得到3'末端含有一个T 的线性载体。第一种方法在制备T载体的过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中两端的序列有时会被部分删除等问题。第二种方法中因为氨苄青霉素易被宿主菌表达出来的￠-内酰胺酶降解，形成卫星菌落，不利于平板菌的保存和放置。有鉴于此，制备一种为下游克隆提供高效保证的T载体，成为一项至关重要的研究课题。
发明内容
针对现有技术中T载体制备过程中存在加尾效率较低，平板菌不易保存等问题， 本发明提供了一种前T载体、T载体及其制备方法。根据本发明，提供了一种前T载体、T载体及其制备方法。其中，前T载体具有序列表中序列13的核苷酸序列，采用Eamll05I限制性内切酶酶切该前T载体，得到pUC57卡那霉素抗性T载体，前T载体的制备方法包括以下步骤I)设计酶切位点将pUC57载体上的氨苄青霉素基因剪切下来，并以此为模板设计三对引物KAN-F 与 KAN-R，AlwNI-F 与 AlwNI-Kan-R 及 Kan-AatII-F 与 Aatll-R，三对引物具有序列表中序列I 6中的核苷酸序列；2)将pET28_a的卡那霉素基因扩增下来，将卡那霉素基因与上游酶切位点间的序列及卡那霉素基因与下游酶切位点间的序列扩增下来，分别得到片段KAN、片段 AlwNI-Kan及片段Kan-Aatll，三个片段分别具有序列表中序列7 9的核苷酸序列，利用 overlapping技术连接片段KAN、片段AlwNI-Kan、片段Kan-AatII，将得到的PCR产物进行双酶切；3)将氨苄青霉素PUC57进行双酶切，得到的酶切产物与步骤2)中的酶切产物连接，得到卡那霉素PUC57 ；4)以猪圆环病毒2型为模板设计一对引物pUC57-KAN-R及pUC57_KAN_F，猪圆环病毒2型具有序列表中序列12的核苷酸序列，引物分别具有序列表中序列10 11的核苷酸序列；5)将步骤4)中的引物进行扩增，对扩增产物进行酶切；6)将卡那霉素PUC57载体进行酶切，得到的酶切产物与步骤5)中的酶切产物连接，在卡那霉素平板上挑选白色菌落，培养并测序，得到PUC57卡那霉素抗性前T载体。优选地，步骤2)中片段KAN扩增所采用的载体为pET28_a，片段AlwNI-Kan扩增所采用的载体为PUC19，片段Kan-AatII扩增所采用的载体为pUC19 ；优选地，步骤2)中双酶切PCR产物采用的内切酶为AlwNI和AatII ；优选地，步骤3)中双酶切氨苄青霉素PUC57采用的内切酶为AlwNI和AatII ；优选地，步骤4)中的猪圆环病毒2型为单链环状DNA ；优选地，步骤5)中对扩增产物进行酶切采用的内切酶为XbaI及BamHI ；优选地，步骤6)中对pUC57_Kan载体进行酶切采用的内切酶为XbaI及BamHI。本发明的有益效果在于l)pUC57是一种高拷贝质粒，有蓝白斑筛选功能，但由于氨苄青霉素易被宿主菌表达出来的￠-内酰胺酶降解，形成卫星菌落，不利于平板菌的保存和放置，我们通过基因合成技术，将PUC57载体改造成具有卡那霉素抗性的载体，实现前T载体的制备，避免菌体表达出￠-内酰胺酶，破坏氨苄青霉素，造成卫星菌落，对挑取克隆造成困难。2)我们对改造后的载体进行￠-半乳糖苷酶的启动子区域的序列重排以引入 GACGTC位点，重排后不影响a肽链的正确编码。3)在T载体制备的过程中引入SAP (虾碱性磷酸酶)与Eamll05I限制性内切酶共同作用，除去5'末端的磷酸基，避免T-A克隆时载体自连的情况发生。
读者在参照附图阅读了本发明的具体实施方式
之后，将会更清楚地了解本发明的各个方面。其中，图I示出了依据本发明，T载体的制备方法流程图2示出了对前T载体进行P -半乳糖苷酶的启动子区域的序列重排后的测序图P曰。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明的技术内容，下面参照附图，对本发明的实施方式作进一步的详细描述。本发明提供一种前T载体，具有序列表中序列13的核苷酸序列，采用Eamll05I限制性内切酶酶切该前T载体，得到pUC57卡那霉素抗性T载体。制备前T载体的具体操作方法包括以下步骤I、将氨苄青霉素PUC57改造成卡那霉素PUC57调整primer5软件的运行环境为Win9x/NT/2000/XP/2003，利用primer5软件设计的酶切位点将PUC57载体上的氨苄青霉素基因剪切下来，并以此为模板设计三对引物 KAN-F 与 KAN-R，AlwNI-F 与 AlwNI-Kan-R 及 Kan-AatII-F 与 Aatll-R，引物序列为KAN-F TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGKAN-R TATGAGCCATATTCAACGGGAAACAlwNI-F ACTGGCAGCAGCCACTAlwNI-Kan-R GTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATAT ACKan-AatII-F ATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCT CATGAatII-R GTTTCTTAGACGTCAGGTGGC使用上述引物扩增pET28_a的卡那霉素基因，卡那霉素基因与上游酶切位点间的序列，及卡那霉素基因与下游酶切位点间的序列，得到片段KAN、片段AlwNI-Kan及片段 Kan-AatII,具体步骤如下所示I)扩增pET28_a的卡那霉素基因以pET28_a为载体，加入pET28_aliil，引物KAN-F与KAN-R各I Ul，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) I ii I, IOXbuffer 5 y I,高保真酶(PFU enzyme) I y I,双蒸水 20 y I,轻轻混匀，离心，PCR扩增得到片段KAN，扩增产物具有序列表中序列I的核苷酸序列，序列I由817 个碱基组成。2)扩增卡那霉素基因与上游酶切位点间的序列以pUC19 为载体，加入 pUC191ii 1，引物 AlwNI-F 与 AlwNI-Kan-R 各 Iu 1，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) I V- I, IOXbuffer 5 U I,高保真酶(PFU enzyme) lul,双蒸水 20 y I,轻轻混匀，离心，PCR扩增得到片段AlwNI-Kan，扩增产物具有序列表中序列2的核苷酸序列， 序列2由448个碱基组成。3)扩增卡那霉素基因与下游酶切位点间的序列以pUC19 为载体，加入 pUC191ii 1，引物 Kan-Aatll-F 与 AatII-R 各 Iu 1，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) I V- I, IOXbuffer 5 U I,高保真酶(PFU enzyme) lul,双蒸水 20 y I,轻轻混匀，离心，PCR扩增得到片段AlwNI-Kan，扩增产物具有序列表中序列3的核苷酸序列， 序列3由153个碱基组成。
利用overlapping的技术，将片段KAN、片段AlwNI-Kan及片段Kan-AatII连接起来得到一条1400个碱基左右的条带，具体操作步骤为加入片段KAN、片段AlwNI-Kan 及片段Kan-AatII各I ul，引物AlwNI-F及引物AatII-R各带一个酶切位点，作为两端引物分别加入Iu 1，三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) I yl，10 X buffer 5u I,高保真酶(PFU enzyme) I iil，双蒸水18 yl，进行PCR反应95 °C预变性3分钟，95 °C变性30秒，55 °C退火 30秒，72°C延伸2分钟，进行45个循环，72°C保温7分钟。取16 U I回收纯化的PCR产物，加入IOXbuffer 2u I, AlwNI限制性内切酶及 AatII限制性内切酶各lul，37°C酶切过夜。取16 u I氨苄青霉素PUC57，加入IOXbuffer
2u IjAIwNI限制性内切酶及AatII限制性内切酶各I yl，37°C酶切过夜。将上述PCR酶切产物与氨苄青霉素PUC57酶切产物进行连接取PCR酶切产物 4u I,氨苄青霉素pUC57酶切产物4 iil，T4buffer Iu I, T4DNA连接酶I yl，22 °C连接过夜。 至此，我们已经将氨节青霉素pUC57改造成卡那霉素pUC57。2、卡那霉素pUC57的线性载体的改造以猪圆环病毒2型为模板，设计引物pUC57-KAN-R及pUC57_KAN_F，引物序列为PUC57-KAN-F TCTAGATATCAGACTATCAGTCACAGCAAGAAGAATGGAAGAAGPUC57-KAN-R GGATCCGGACTGATAGTCGGACAGCAGTTGAGGAGTA该猪圆环病毒2型为单链环状DNA，具有序列表中序列4的核苷酸序列。取猪圆环病毒2型DNAliil，引物pUC57-KAN-Rliil，引物pUC57_KAN_Fl yl，三磷酸脱氧核苷酸 (dNTP) lul, 10Xbuffer 5 U I,高保真酶(PFU enzyme) I U 1，双蒸水 18 U I,进行 PCR 扩增反应95°C预变性3分钟，95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸I分钟，进行30个循环，72 °C保温7分钟。取XbaI限制性内切酶Iul，BamHI限制性内切酶I yl，IOXbuffer 2yl，PCR产物16 iil，对PCR产物37 °C酶切过夜。取XbaI限制性内切酶I yl，BamHI限制性内切酶Iyl， IOXbuffer 2iU，卡那霉素pUC5716ii 1，对卡那霉素pUC57进行酶切，37°C酶切过夜。将上述PCR酶切产物与卡那霉素pUC57酶切产物进行连接取PCR酶切产物4 yl， 卡那霉素PUC57酶切产物4iU，T4buffer Iu I, T4DNA连接酶I yl，22°C连接过夜。对改造后的载体进行￠-半乳糖苷酶的启动子区域的序列重排，化学合成重排序列并克隆到目的载体上，以引入GACGTC位点。在卡那霉素平板上挑选白色菌落，LB液体培养基，180r/min，37°C过夜培养并测序，得到如图2所示的测序图谱。至此，pUC57卡那霉素抗性前T载体制备完成。3、制备pUC57卡那霉素抗性T载体取Eaml 1051限制性内切酶I yl，IOXbuffer 2 iU，pUC57卡那霉素抗性前T载体 16 U 1，37°C酶切过夜，得到具有pUC57卡那霉素抗性的T载体。因此，藉由本发明的前T载体、T载体及其制备方法，可以避免菌体表达出￠-内酰胺酶，从而破坏氨苄青霉素，造成卫星菌落，对挑取克隆造成困难，并且改造后的PUC57载体在￠-半乳糖苷酶的启动子区域的序列重排不影响a肽链的正确编码，可以进行蓝白斑筛选，同时保存了多克隆位点，为实验下游的克隆提供保障。上文中描述了本发明的具体实施方式
。但是，在本领域中的普通技术人员能够理解，不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式
作各种变更和替换。这些变更和替换都落在本发明权利要求书限定的范围内。
权利要求
1.一种前T载体，其特征在于，所述前T载体具有序列表中序列13的核苷酸序列。
2.一种T载体，其特征在于，采用Eamll05I限制性内切酶酶切所述前T载体，得到 PUC57卡那霉素抗性T载体。
3.一种前T载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)设计酶切位点将PUC57载体上的氨苄青霉素基因剪切下来，并以此为模板设计三对引物KAN-F 与 KAN-R，AlwNI-F 与 AlwNI-Kan-R 及 Kan-AatII-F 与 Aatll-R，所述三对引物具有序列表中序列I 6中的核苷酸序列；2)将pET28-a的卡那霉素基因扩增下来，将所述卡那霉素基因与上游酶切位点间的序列及所述卡那霉素基因与下游酶切位点间的序列扩增下来，分别得到片段KAN、片段 AlwNI-Kan及片段Kan-Aatll，所述三个片段分别具有序列表中序列7 9的核苷酸序列， 利用overlapping技术连接所述片段KAN、片段AlwNI-Kan、片段Kan-AatII,将得到的PCR 产物进行双酶切；3)将氨苄青霉素PUC57进行双酶切，得到的酶切产物与所述2)中的酶切产物连接，得到卡那霉素PUC57 ；4)以猪圆环病毒2型为模板设计一对引物pUC57-KAN-R及pUC57_KAN_F，所述猪圆环病毒2型具有序列表中序列12的核苷酸序列，所述引物分别具有序列表中序列10 11的核苷酸序列；5)将所述步骤4)中的引物进行扩增，对扩增产物进行酶切；6)将所述卡那霉素PUC57载体进行酶切，得到的酶切产物与所述步骤5)中的酶切产物连接，在卡那霉素平板上挑选白色菌落，培养并测序，得到PUC57卡那霉素抗性前T载体。
4.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述片段KAN 扩增所采用的载体为pET28-a，所述片段AlwNI-Kan扩增所采用的载体为pUC19，所述片段 Kan-AatII扩增所采用的载体为pUC19。
5.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中双酶切所述 PCR产物采用的内切酶为AlwNI和AatII。
6.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中双酶切所述氨苄青霉素PUC57采用的内切酶为AlwNI和AatII。
7.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的猪圆环病毒2型为单链环状DNA。
8.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中对所述扩增产物进行酶切采用的内切酶为XbaI及BamHI。
9.如权利要求3所述的前T载体的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中对pUC57-Kan 载体进行酶切采用的内切酶为XbaI及BamHI。
全文摘要
本发明提供一种前T载体、T载体及其制备方法，包括具有序列表中序列13的核苷酸序列的前T载体，采用Eaml105I限制性内切酶酶切前T载体得到的具有pUC57卡那霉素抗性的T载体，及这种前T载体的制备方法。采用本发明的前T载体、T载体及其制备方法，可以避免菌体表达出β-内酰胺酶，从而破坏氨苄青霉素，造成卫星菌落，对挑取克隆造成困难，并且改造后的pUC57载体在β-半乳糖苷酶的启动子区域的序列重排不影响α肽链的正确编码，可以进行蓝白斑筛选，同时保存了多克隆位点，为实验下游的克隆提供保障。
文档编号C12N15/65GK102604981SQ20121004431
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者孙子奎, 孟和, 王 锋, 许波亮 申请人:上海派森诺生物科技有限公司