专利名称：白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及文昌鱼肌动蛋白基因，特别涉及白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子及其应用。
背景技术：
文昌鱼(Amphioxus)隶属脊索动物门(Chordate)头索动物亚门 (Cephalochordate)，它处于无脊椎动物进化到脊椎动物一个重要的过渡阶段，是现存生物中最类似于脊椎动物亚门直接祖先的类群之一。因其独特的进化地位，且结构简单，身体半透明，基因组仅为人类的1/6，呈现出基因倍增前脊椎动物祖先的基因组的特征(1、 Balczarek, K. A. , Lai, Z. C. , Kumar, S. , Evolution of functional diversification of the pair box (Pax)DNA-binding domains. Molecular. Biology and Evolution[J]. 1997. (14)，拟9-842.)。随着对文昌鱼的研究日益深入，佛罗里达文昌鱼(Branchiostoma flloridae)和白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)全基因组测序完成，尤其是文昌鱼实验室连续繁殖的成功(2、Zhang, Q. J.，Sun, Y.，Zhong，J.，Li，G.，Lu, Χ. Μ.，Wang， Y. Q, Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generation in laboratory.Journal of Experimental Zoology(Molecular and Developmental Evolution) [J] · 2007，308 (4)，464-472)以及显微注射技术的稳定建立， 极大地推动了文昌鱼的模式化进程。在其他模式生物中成功应用的生物技术，如RNA干扰技术和细胞培养技术等同样在文昌鱼中逐步建立。作为一种新型的模式生物，研究其调控目的基因表达的分子工具是必不可少的，到目前为止，只有佛罗里达文昌鱼中i^ox D基因启动子(3、Yu, J. K.，Holland，N. D.，Holland，L. Ζ.，Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.Development Biology. 2004. (274)， 452-461)被报道。在现有的几种模式生物中，已建立了一些调控基因表达系统，如四环素诱导系统(5、 Gossen, M. ， and Bujard， H. ， Anhydrotetracycline, a novel effector for the tetracycline controlled gene expression systems in eukaryotic cells. Nucleic Acids Research，1993. 21,4411-4412)，Gal/UAS 系统(6、Lewandoski, Μ.，Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2001. 2(10)， 743-75 ，或是开发一些组织特异性的启动子或是增强子，如vasa基因启动子能使下游目的基因只在生殖细胞中表达(7、Tanaka, M.，Kinoshita, M.，Kobayashi, D.， Nagahama, Y. , Establishment of medaka(Oryzias latipes)transgenic lines with the expression of green fluorescent protein fluorescence exclusively in germ cells :a useful model to monitor germ cells in a live vertebrate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. 98(5)，2544-2549)，肾细胞特异的钙粘着蛋白基因的启动子能引导报告基因在肾脏和生殖泌尿道中特异表达(8、 Shao, X. L.，Johson, J. E.，Richardson，J. Α.，Hiesberger, Τ.，Igarashi, P.，AminimalKsp—Cadhe—rin promoter linked to a green fluorescent protein reporter gene exhibits tissue-specific expression in the developing kidney and genitourinary tract. Journal of American. Sociology. 2002. 13，1824-1836)。然而以上所提到两种方法存在不可克服的弊端，一是需要幵发数目众多的组织特异性的启动子或是增强子， 同时不易调控靴基因的表达(9、Rome，C.，Couillaud, F.，Moonen, C. T. W.，Spatial and temporal control of expression of therapeutic genes using heat shock protein promoters. Methods [J]. 2005. 35，188-198)，二是化学药物诱导，对机体有害或有潜在的副作用(10、Oda, S.，Mikami，S.，Urushihara, Y.，Murata, Y.，Kamei，Y.，Deguchi，T.， Kitano, T.，Fujimori，K. Ε·，，Yuba, S.，Todo, T.，Mitani, H.，Identification of a functional medaka heat shock promoter and characterization of its ability to induce exogenous gene expression in medaka in vitro and in vivo. Zoological Science. 2010. 27 (5)，410-415)。因而，在新型模式生物文昌鱼中需要建立更好的表达调控系统。肌动蛋白基因启动子作为分子工具可用于基因上游转录调控元件以及外源基因表 iiff^ (lUMcElroy, D. ，Zhang, W G. ，Cao, J. ，Wu, R. ，1990. Isolation of an Efficient Actin Promoter for Use in Rice Transformation. The Plant Cell，Vol. 2，163-17L 12、 Liu, Z J.，Moav, B.，Faras, A J.，Guise，K S.，Kapuscinski，A R.，Hackett，P B.，1990. Functional analysis of elements affecting expression of the beta—actin gene of carp. Mol Cell Biol. July ；10(7) :3432-3440. 13、Liu, Z J. ， Moav, B. ， Faras, A J.， Guise，K S.，Kapuscinski，A R.，Hackett, P B.，1991. Importance of the CArG box in regulation of β -actin-encoding genes. Gene，108211-217. 14、Yee，S P.，Righby， PWJ.,1993.The regulation of myogenin gene expression during the embryonic development of the mouse. Genes & Dev. . 7 :1277-1289. 15、Miiller，F.，Williams, DW.， Kobolak J. ,Gauvry L，Goldspink G.，Orban L，Maclean N. ,1997. Activator Effect of Coinjected Enhancerson the Muscle-Specific Expression of Promoters in Zebrafish Embryos. Molecular Reproduction and Development, 47 :404-412. 16、Feng，H.，Cheng， J.，Liu, S J.，Liu, Y. , 2006. Cloning of Black Carp β-actin Gene and Primarily Detecting the Function of Its Promoter Region. Acta Genetica Sinica,33 (2) 133-140. 17、Beckmann, S.，Wippersteg, V.，El-Bahay, Α.，Hirzmann, J.，Oliveira，G.， Grevelding， C G. ，2007.Schistosoma mansoni :Germ_line transformation pproaches and actin-promoter analysis. Experimental Parasitology,117 292-303.18、Goode， D.，Callaway, H A.，Cerda，G A.，Lewis, K E.，Elgar G. , 2011. Minor change，major difference :divergent functions of highly conserved cis—regulatory elements subsequent to whole genome duplication events· Development，138，879-884)。在转基因斑马鱼、小鼠等模式动物中都得到很好的应用，但对文昌鱼肌动蛋白基因启动子的研究目前还是空白。除此之外，自身启动子应该比其他物种来源的要更合适文昌鱼的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子和最小启动子。本发明的第二目的在于提供白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子和最小启动子在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子的核苷酸序列为gccctagatt gtttcacatc tggtgtagct acaccaatat tgggcttgcc cagtacacgc 60catgagtaag caatgctgcc attgtgtaaa catgggggca tccctccaca ggaccatatt 120tggcaagcaa aattgtgtct cacctgagca agggctgctg atattgtgat aagcctggat 180ttgcatacta taggatgggt gtggccacat attctgtgct aatgaatagt aaatactagc 240tgccttttct tttgtgcatt gtcattgtgc atttgatttg gatttttcct aaactttcct 300ttatctacta aactttgtga ttttggtgct tgcatgctca ttagttttgt gtaaatttgt 360tgtgcttagg gaagtcatat ttgagtgtag ggaagtcttt tcctgcagaa aactaggttg 420tgtggatgtt cctgaaaatg tggggggaag acttcctcat tcctaactgc tgtgagtcat 480ggctggctgc ctggttgata tgtcagaaga ggaagtggct agtaagtggg ggcaggaagg 540gcttcccctg acacctgatg tccaaatatg gccctggctc cttgccctat aaggctttgg 600gtgtgtcctt atatgggcat cagcctctgt ctgattggtg agtcagggaa gtgacatcat 660ccaaccactc accatatcca gtgcttataa gcagtgctct ctggcttctt tcattcattc 720ggtgctcttg cattttgctg ctcca745所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因最小启动子的核苷酸序列为gcatcagcct ctgtctgatt ggtgagtcag ggaagtgaca tcatccaacc actcaccata 60tccagtgctt ataagcagtg ctctctggct tctttcattc attcggtgct cttgcatttt 120gctgctcca129所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子和最小启动子可在调控白氏文昌鱼基因表达中应用。所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子可有效调控下游基因表达，克隆分离的最小启动子可用于文昌鱼转录调控元件如增强子等的功能的研究，而肌动蛋白基因的基本启动子则可以用作对感兴趣的基因功能在不同时间上，不同空间上的研究。将该启动子介导的目的基因整合到文昌鱼基因组中，建立转基因文昌鱼，即可对文昌鱼的不同发育时期或是不同部位的目的基因进行研究。由此可见，白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子可用于调控白氏文昌鱼基因的表达。白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子和最小启动子启动效率极高。且为白氏文昌鱼内源性的启动子，可以方便的应用于即应能以及转录调控元件的研究。本发明成功克隆了文昌鱼肌动蛋白基因的上游745bp序列的基本启动子和129bp的最小启动子，并将该片段载入带有LAcZ基因的报告载体，在文昌鱼胚胎进行功能检验，已证明这两个片段确实是基本启动子和最小启动子，可作为调控文昌鱼基因时空表达的分子开关和转录调控元件功能的分子工具。
图1为不同重组质粒在文昌鱼胚胎表达数据统计图。745bp的重组质粒在体节(s) 表达量最高，在脊索(n)，神经脊(nc)，外胚层(e)等也有表达，表达效率为91. 46% ;U9bp 的重组质粒表达效率为0 ；U9bp前面插入增强子元件的重组质粒的表达部位主要在体节 (s)和脊索(η)，在神经脊(nc)，外胚层(e)也有表达，表达效率为93. 82%。U9bp前面插入随即片段的重组质粒的表达效率为0 ；LacZ重组质粒载体及其表达情况 f ； TATA Box I ；CArG Motif ■ =CAAT Box图2为文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子和最小启动子介导LacZ在文昌鱼中的表达情况。A C和E G都为左侧面观；D和H是文昌鱼石蜡切片的图片(D切片的鱼样品来自C ；H切片的鱼样品来自G) ；A、B、E、F 神经胚约14体节的照片；C、G 开口前幼体的照片；表达部位s :Somite (体节)，η :Notochord (脊索)，η c =Nerve cord (神经脊)，e Ectoderm (外胚层)，ρ =Pharynx (咽)，ectopic (异位表达)。
具体实施例方式实施例1白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子序列获取1、白氏文昌鱼肌动蛋白基因家族鉴定以及EST数据处理用佛罗里达文昌鱼的肌动蛋白基因序列(19,Wei, Y. , H. , Zhang, Y. , J. , Chen, Y.， Mao,B. ,Y. ,2009. Expanssion of the The Actin Gene Family in amphioxue. Zoological Research, 30 (5) :473-479)做饵通过同源性序列分析BlastN程序将所有白氏文昌鱼肌动蛋白基因从中山大学刚释放出来的基因组中定位出来。总共找到了 33个肌动蛋白基因。通过进化分析对这些基因进行了归类，肌动蛋白蛋白序列比对有CLUSTAL_W程序完成(20、Thompson, J. , D. , Higgins, D. , G. , Gilson, Τ. , J. , 1994. CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res. (1994) 22 (22) :4673-4680)，比对结果用于系统树构建。系统邻接树由MEGA5. 0软件完成，参数为泊松距离法。这些肌动蛋白基因被分为3类分别是胞质型，肌肉型，以及介于两者之间的。此外通过对佛罗里达文昌鱼和白氏文昌鱼EST数据的处理，确定了一个高表达的白氏文昌鱼β型胞质型肌动蛋白基因Actin-6-2，用于后续启动子功能的研究。2、β -Actin-6-2上游区域序列分析结合实验之前白氏文昌鱼cDNA测序的数据和中山大学释放的数据，对选取的白氏文昌鱼β -Actin-6-2基因的转绿起始位点进行预测。对转录起始位点上游约1Kb的序列进行分析，发现其包含了 β-Actin启动子所具有的典型调控元件CAAT box, CArG motif, TATA box。针对包含有这3个调控元件的转录起始位点上游74^p的序列，设计了一对特异引物，引物序列为Actin-Fl CCCAAGCTT GCCCTAGATTGTTTCACATCTGG,下划线斜体部分为 HindIII酶切位点；Actin-R TTTGCGGCCGCFGGAGCAGCAAMTGCAAGAG,下划线斜体部分为 Not I 酶切位点下划线斜体部分为EcoR I酶切位点，对该区域进行PCR扩增，获得白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子。进而研究设计了一对特异引物PCR扩增上述3个元件中只含有TATA box的区域来研究最小启动子的功能，该区域只含有129bp，引物序列Actin-F2 CCCAAGCTT GCCCTAGATTGTTTCACATCTGG,下划线斜体部分为 HindIII酶切位点，Actin-R和上述一样。此外，为了验证该129bp的片段是否为最小启动子，进一步选取了一个已知的佛罗里达文昌鱼ZNF503/703基因附近的增强子序列01， Holland et al,2008, The amphioxus genome illuminates vertebrate origins andcephalochordate biology. Genome Res, 18(7) :1100-11.)到中山大学白氏文昌鱼基因组中BlastN，将其在白氏文昌鱼中的对应的同源序列定位出来，将该段增强子序列(1748bp) 从白氏文昌鱼基因组中通过PCR扩增出来(在白氏文昌鱼基因组中该增强子片段同样位于 ZNF503/703基因的上游)，特异引物的序列为Enhancer-F CCCAAGCTT FGTTCGCGTTTTTGTTTGACAAG,下划线斜体部分为 HindIII酶切位点；Enhancer-R CCCAAGCTT FCAACAGTCCTTCGCAGATGTTT,下划线斜体部分为 HindIII酶切位点，最后，随即选择了一段白氏文昌鱼基因组序列(636bp)从另一个角度来验证该129bp片段的功能，随机片段引物的序列。Random-F :CCC AAGCTT AGCAAACATTTGGGGAGGTG,下划线斜体部分为 HindIII 酶切位点；Random-R :CCC AAGCTT CTGTTTGTTCGTTAGCGTTG,下划线斜体部分为 HindIII 酶切位点。所得白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子的核苷酸序列为gccctagattgtttcacatctggtgtagctacaccaatattgggcttgcccagtacacgc60
catgagtaagcaatgctgccattgtgtaaacatgggggcatccctccacaggaccatatt120
tggcaagcaaaattgtgtctcacctgagcaagggctgctgatattgtgataagcctggat180
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ggtgctcttg cattttgctg ctcca745白氏文昌鱼肌动蛋白基因最小启动子的核苷酸序列为gcatcagcct ctgtctgatt ggtgagtcag ggaagtgaca tcatccaacc actcaccata 60tccagtgctt ataagcagtg ctctctggct tctttcattc attcggtgct cttgcatttt 120gctgctcca129。实施例2白氏文昌鱼热休克蛋白70基因启动子1、构建重组表达质粒将扩增的2个启动子区域的PCR产物经Hindlll，Not I双酶切处理，载入经过同样双酶切处理的LacZ(该载体无启动子，台湾中央研究院游智凯教授惠赠)载体中，转化 DH5 α菌株，经PCR及酶切鉴定后得到阳性克隆进行测序，证明插入片段无误，同样地将由 PCR获得的增强子片段和随机片段经HindIII单酶切处理，载入经过HindIII单酶切处理的已经获的插入129bp的LacZ报告载体中，经转化，酶切，测序获得阳性克隆，最后进行功能验证。总共构建4种LacZ的重组质粒包含3个元件(CAAT box, CArG box, TATA box)的74^ρ的重组质粒；只包含TATA box的129bp的重组质粒；U9bp序列上游插入一个增强子的重组质粒；U9bp序列上游插入一个随即片段的重组质粒(参见图1)。2、显微注射文昌鱼胚胎运用文昌鱼胚胎显微注射技术，将构建好的重组质粒拿到文昌鱼胚胎中进行验证。注射的文昌鱼胚胎为未受精卵，采用45°C斜向下进针的方式注射卵中，每个未受精卵注射量约为1 2μ 1，注射的重组质粒浓度约为lOOng/μ 1，加入适量海水和精液(根据当天精液浓度和受精情况调整用量)，若精液浓度不够，可加入适量NH4CL溶液，刺激精子活力。 受精后，跟换新鲜海水，以免过量受精，破坏受精膜影响其发育。置于恒温恒湿培养箱中培养(温度25°C)。缓慢将培养皿中发育的受精卵转移到装有新鲜海水的结晶皿(直径60mm) 中继续培养。显微操作仪为Narishige IM-30型和Eppendorf Transferman NK2。每种重组质粒卵注射情况见图1，活性染色表明的片段启动效率为91. 46%，而U9bp启动效率为0，但是在U9bp重组载体加上阳性增强子后，其表达效率达到了 93. 82%，并且表达部位也与该组织特异性增强子的表达部位一样(Holland等，2008)(图1和幻。以上数据充分说明了这段7^bp的序列具有启动子的功能，并且129bp的序列为最小启动子。可利用它与所感兴趣基因建立转基因文昌鱼，时空上开展发育过程中的过表达研究，探讨其功能及其发挥作用的时期，此外还可以用作基因非编码区功能的研究，总之为研究文昌鱼基因功能提供一个有力的工具。
权利要求
1.白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子，其特征在于其核苷酸序列为gccctagattgtttcacatctggtgtagct3. C 3. C C 3.3. 3. tgggcttgcccagtacacgc60catgagtaagcaatgctgccattgtgtaaacatgggggcatccctccacaggaccatatt120tggcaagcaaaattgtgtctcacctgagcaagggctgctgatattgtgataagcctggat180ttgcatactataggatgggtgtggccacatattctgtgctaatgaatagtaaatactagc240tgccttttcttttgtgcattgtcattgtgcatttgatttggatttttcctaaactttcct300ttatctactaaactttgtgattttggtgcttgcatgctcattagttttgtgtaaatttgt360tgtgcttagggaagtcatatttgagtgtagggaagtcttttcctgcagaaaactaggttg420tgtggatgttcctgaaaatgtggggggaagacttcctcattcctaactgctgtgagtcat480ggctggctgcctggttgatatgtcagaagaggaagtggctagtaagtgggggcaggaagg540gcttcccctgacacctgatgtccaaatatggccctggctccttgccctataaggctttgg600gtgtgtccttatatgggcatcagcctctgtctgattggtgagtcagggaagtgacatcat660ccaaccactcaccatatccagtgcttataagcagtgctctctggcttctttcattcattc720ggtgctcttgcattttgctgctcca745。
2.如权利要求1所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因基本启动子在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。
3.白氏文昌鱼肌动蛋白基因最小启动子，其特征在于其核苷酸序列为 gcatcagcct ctgtctgatt ggtgagtcag ggaagtgaca tcatccaacc actcaccata 60 tccagtgctt ataagcagtg ctctctggct tctttcattc attcggtgct cttgcatttt 120 gctgctcca129ο
4.如权利要求3所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因最小启动子在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。
全文摘要
白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子及其应用，涉及文昌鱼肌动蛋白基因，提供白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子及其在调控白氏文昌鱼基因表达中的应用。所述白氏文昌鱼肌动蛋白基因启动子可有效调控下游基因表达，克隆分离的最小启动子可用于文昌鱼转录调控元件如增强子等的功能的研究，而肌动蛋白基因的基本启动子则可以用作对感兴趣的基因功能在不同时间上，不同空间上的研究。将该启动子介导的目的基因整合到文昌鱼基因组中，建立转基因文昌鱼，即可对文昌鱼的不同发育时期或是不同部位的目的基因进行研究。
文档编号C12N15/85GK102559684SQ20121004356
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者冯俊, 刘欣, 李光, 王义权 申请人:厦门大学