专利名称：一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的应用的制作方法
一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因PsIRI的应用技术领域
本发明属于生物技术领域，公开了一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因PsIRl 的应用。
背景技术：
随着世界人口的急剧增长，可耕地面积的减少，世界粮食问题变得日趋严重，在有限的土地资源上耕作出更多的粮食，是解决人类生存的头等大事。育种学家们不仅要提高作物的产量，还要减少作物的损失，其中植物病害一直是阻碍优良品种增产的最大瓶颈，因此，培育高产抗病的作物品质是近年来育种学家们追求的方向。常规的育种方法费时费力， 而随着生物学的发展，利用基因工程的方法来培育的品种，不仅能缩短育种时间，而且可以让多个优良的性状集中到一个品种上，是目前育种领域的应用热点。植物抗病基因工程是指采用遗传转化技术，将外缘的基因导入受体植株，从而获得抗病的转基因植物的方法。一般用于导入受体植物的外缘基因包括植物的抗病基因(即R基因)，病原菌无毒基因和抗病基因共转形成的“双组分系统”，植物的防卫反应基因以及一些生物的抗菌蛋白基因。通过将这些基因构建到合适的载体上，构成适于转化的重组质粒，用不同的转化方法向具有优良品质的受体植物中导入重组质粒，利用合适的抗性筛选并鉴定出转基因植株，通过抗病性鉴定，从而获得高抗优质的品种。生物体内基因众多，例如人类基因组预测有3万个基因以上，大豆疫霉接近2万个基因，大多数基因的功能未知，而生物的生长、发育、遗传、变异乃至生理平衡，无不与基因的表达和调控密切相关，因此，克隆并研究基因的功能对于基因工程来说是研究基础。
本专利所涉及到的基因是一类由病原菌分泌，在侵染过程中可进入植物细胞并引起植物生理生化活性改变的蛋白。已经在细菌中发现大量的这种效应蛋白，而近年来随着基因组的测序，卵菌中也发现大量的效应蛋白，除了大家广为熟悉的RXLR效应蛋白外，还有一类具有保守FLAK序列元件的CRN效应蛋白。迄今为止，将CRN蛋白导入受体植物并能提高植物抗性未见报道。发明内容
为了克服常规育种费时费力、不能具有持久广谱抗性的缺点，本发明提供一个大豆疫霉效应因子I3SlRl做为育种的候选材料，该蛋白可以诱导植物PRl基因的高度表达，引起烟草的抗病性。该基因将为植物抗病基因工程提供具有应用潜力的功能基因，进一步可为生产上提供一种具有持久抗病潜力的育种材料。
本发明的目的可通过如下技术方案实现
一种大豆疫霉PsIRl基因在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用，该大豆疫霉I3SlRl基因序列为GenBank :HQ231784. 1。
其中，所述的转基因植物为转大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。
含有大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的重组表达载体在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用。
其中，所述的转基因植物为转大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。所述的重组表达载体的出发载体为PVX载体。
一种大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)在构建具有烟草疫霉抗性的转基因植物中的应用。
所述的转基因植物为转大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。
含有大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的重组表达载体在构建具有烟草疫霉抗性的转基因植物中的应用。
所述的转基因植物为转大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。所述的重组表达载体的出发载体为PVX载体。
有益效果
本发明与现有的育种材料相比，其优点和积极效果表现在
1.可大大的增强植物抗性。卵菌是具有巨大破坏力的病原菌，自然条件下抗源材料较少。烟草疫霉侵染速度非常快，在发明中，提前在烟草上表达I3S^l (GenBank HQ231784. 1)后接种烟草疫霉，可让烟草疫霉的侵染速度减缓25%以上。
2. PsIRl (GenBank :HQ231784. 1)能够诱导PRl和PR2基因高表达，可为生产上提供具有持久抗性的育种材料。PRl和PR2基因是水杨酸通路的基因，而水杨酸的增加可提高植物的广谱抗性，因此，虽然PsIRl是大豆疫霉的基因，但是在植物上瞬时表达后，能引起 PRl基因的高表达，这表明PsIRl可诱导水杨酸的积累，因而可增强烟草的抗病性。
图IPsIRl可抑制烟草疫霉的侵染
A.叶片左边及右边均表达GFP后接种烟草疫霉菌的病斑酒精脱色后表型B.叶片左边表达GFP，右边表达I^sIRl后接种烟草疫霉菌的病斑酒精脱色后表型C.图A和图B中叶片右边与左边病斑直径比值。*代表在的水平上差异显著。
图2PsIRl可引起水杨酸通路防卫反应基因PRl和PR2的高表达
A. PsIRl和GFP分别在烟草上表达5天后，检测SA通路PRl基因相对于0天的表达量，设定Od的表达量为10，比值取IoglO ；
B. PsIRl和GFP分别在烟草上表达5天后，检测SA通路PR2基因相对于0天的表达量，设定Od的表达量为10，比值取IoglO具体实施方式
实施例IPsIRl可抑制烟草疫霉的侵染
1.载体构建
根据 Liu, et al, Two host cytoplasmic effectors are required for pathogenesis of Phytophthora sojae by suppression ο f host defenses. Plant physiology, 2011,155,1 :490-501 文章中构建方法获得 PVX:PsIRl 和 PVX:GFP 质粒。
2.农杆菌介导的瞬时表达
将PVX:PsIRl和PVX:GFP质粒通过电转化技术转入GV3101农杆菌(Biovector) 菌株中，将农杆菌的阳性转化子于3ml添加kanamycin (50 μ g/ml)的LB培养液中，220rpm,培养48h，4000rpm离心％iin，收集菌体，用IOmM MgCl2重悬，重复三次后，用IOmM MgCl2定容至0D600 = 0. 4-0. 6。取生长6_8周的烟草，从上数第三至第六片完全展开的真叶被用于渗透接种农杆菌。用针头在烟草下表皮造成一小伤口，用ImL无针头的注射器将 30-50 μ 1农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。
3.烟草疫霉接种和病斑长度测量
农杆菌表达5天后取下注射的烟草叶片，放在培养皿里面滤纸保湿，然后用培养 3-5天烟草疫霉菌丝块接种处理过的烟草叶片，随时观察和记录烟草叶片的表型变化，2天后，用酒精脱色后测量病斑直径。与对照相比GFP相比，PsIRl可以显著限制烟草疫霉的侵染，至少可使烟草疫霉的侵染速度减缓25%以上(图1)。
实施例2PsIRl引起水杨酸通路防卫反应基因的高表达
将实施例1中获得的PVX:PSIR1和PVX:GFP按照实施例1的方法在烟草上瞬时表达，分别在表达Od和5d时取样，按照Total RNA Purification System试剂盒(Invitrogen)提供的ftOtocal进行。荧光定量PCR操作按照ABI 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)软件和指南进行。PCR 反应液使用 Real time PCR 试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM, TaKaRa, DaLian, China)来进行反应。以瞬时表达烟草叶片所提取的RNA进行逆转录，将获得的cDNA为模板进行相对定量PCR扩增。 M 50ng 的 cDNA 禾口 0. 2 μ M 弓| 物，0. 4ul ROX Reference Dye 及 IOul SYBR Premix Ex TaqTM混合于20 μ 1的PCR反应体系中。PCR程序为95°C 30秒预变性，40个循环PCR反应(95°C 5秒，65°C 31秒)，引物的特异性通过融解曲线和电泳来判断。本研究中所用到的引物见表1。
与Od未处理的烟草叶片相比，PsIRl可显著提高SA通路基因ra2b和PRb-Ib基因的表达，分别引起ra2b和PRb-Ib的表达量提高约10000和20000倍，而GFP对照仅提高分别为1000倍和100多倍(图2)。由此可见，PsIRl可以显著引起SA通路防卫反应基因的表达。
表1本研究中所用到的荧光定量引物
权利要求
1.一种大豆疫霉I3SlRl基因GenBank :HQ231784. 1在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉I3sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。
3.含有大豆疫霉I^sIRl基因GenBank:HQ231784. 1的重组表达载体在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体的出发载体为PVX载体。
6.一种大豆疫霉I3SlRl基因GenBank :HQ231784. 1在构建具有烟草疫霉抗性的转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。
8.含有大豆疫霉I^sIRl基因GenBank:HQ231784. 1的重组表达载体在构建具有烟草疫霉抗性的转基因植物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的烟草，大豆，水稻，小麦或玉米。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体的出发载体为PVX载体。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的应用。一种大豆疫霉PsIR1基因(GenBankHQ231784.1)在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用。本发明将大豆疫霉基因PsIR1插入PVX表达载体，并通过农杆菌介导的瞬时表达在烟草上对PsIR1的功能进行了分析。结果发现PsIR1可显著提高烟草对疫霉的抗性，并且PsIR1可诱导水杨酸通路防卫反应基因PR1和PR2的高表达。因此，可认为PsIR1可引起了水杨酸的积累，而水杨酸的增加可提高植物的广谱抗性，可见PsIR1可增强烟草的抗病性。
文档编号C12N15/84GK102533852SQ20121004345
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者刘廷利, 刘沛菡, 刘莉, 窦道龙, 茹艳艳 申请人:南京农业大学