专利名称：一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌工程菌，其构建方法，以及其在生产肝素酶I中的应用。
背景技术：
肝素是一类长链糖胺聚糖，由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸以β_1，4糖苷键连接组合而成，临床上主要用来预防血栓或作为体外抗凝血药物使用。低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH)是从普通肝素中分离得到或裂解肝素产生的低分子量片段，其分子量约在4000Da 6000Da。与普通肝素相比，LMWH具有更多优势，比如生物利用度高、血浆半衰期长、口服易吸收、抗血栓作用显著增强以及诱发出血的作用显著减弱等， 从而被广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗。虽然LMWH有诸多优点，但其价格远远高于普通肝素，给患者带来了沉重的经济负担。目前工业生产LMWH的方法多为化学降解和酶降解法，其中酶法具有反应条件温和、专一性高、不引起肝素结构的破坏和不易带入杂质等优点。肝素酶(heparinase)是一类能够特异性降解肝素和类肝素糖苷键的酶，在清除血液中的肝素抗凝剂、测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面都有重要的应用价值。尿毒症患者的血液透析和心脏手术中体外血液循环中残留的肝素用肝素酶来消除，避免了用鱼精蛋白引起的各种毒性反应。由于肝素酶能特异性降解肝素产生特定片段，分析这些片段的结构与功能，可了解肝素的构效关系，促进应用。肝素酶还能作用于胞外基质中的类肝素，产生具有活性的肝素小分子，这些小分子可抑制毛细血管上皮细胞的增殖，从而阻止新血管形成而起到抗肿瘤作用。另外，肝素酶还有促进伤口愈合的作用(Msisekharan R， Moses MA, Nugent MA, et al. Heparinase inhibits neovascularization[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91 (4) :1524-1528.)(Karthik R, Balagurunathan K. Differential effects of heparitinase I and heparitinase III on endothelial tube formation in vitro [J] Biochem Biophys Res Commun，2010，398 :191—193.)。肝素酶最初是由 Payza 等(Payza AN,Korn ED. Bacterial degradation of heparin[J]Nature,1956,177(4498) 88-89.)从肝素黄杆菌中发现并由 Bohmer 等(Bohmer LH, Pitout MJ, Steyn PL, et al.Purification and characterization of a novel heparinase[J]. J Biol Chem, 1990,265(23) :13609-13617.)分离出来的，目前已经从肝素黄杆菌中分离纯化得到3种肝素酶H印arinase I , Heparinase II和H印arinase III。本发明所述肝素酶I分子量 43. 8kD，等电点8. 5，主要降解肝素分子中的2SIdoA(l —4)6SGlcNS糖苷键(Desai UR, Wang HM, Linhardt RJ. Specificity studies on the heparin lyases from Flavobacterium heparinum[J]. Biochemistry, 1993，32 (32) :8140-8145.)，对其催化区域的考察发现，肝素酶I有三个底物结合位点、两个钙离子激活位点和一个糖基化位点，而糖基化对肝素酶I 的酶活没有影口向(Sasisekharan R，Ganesh V，Godavarti R，et al. Heparinase I from Flavobacterium heparinum :mapping and characterization of the heparin bindingdomain[J], J Biol Chem，1996，271 :3214-3131. )(Liu D, Shriver Z, Godavarti R, et al. The calcium-binding sites of heparinase I from Flavobacterium heparinum are essential for enzymatic activity[J]. J Biol Chem，1999，274 (7) :4089-4095.)。枯草芽孢杆菌已广泛用于工业酶制剂的生产中，该系统具有诸多独特的优势，比如生物安全性好，是FDA和农业部批准使用的安全菌株；属革兰氏阳性菌，无内毒素；生长迅速，培养简便；可直接将表达产物分泌到培养基中；没有明显的密码子偏爱性，遗传背景清楚，是分泌表达外源基因的良好受体菌。自Spizizen于1958年发现枯草芽孢杆菌168 菌株为可转化菌株以来，已经在枯草芽孢杆菌及其近缘种中克隆和表达了大量的原核和真核基因。而针对枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶活性强的缺点构建的多种蛋白酶缺失菌株，以 WB600、WB700、WB800等应用最广，已基本成为较完善的外源基因表达系统。已有大量的蛋白质类药物在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达，但至今还未见肝素酶I在该系统中成功表达的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一株能够高效分泌表达重组肝素酶I的枯草芽孢杆菌工程菌，其构建方法，以及其在生产肝素酶I中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的一株枯草芽孢杆菌工程菌，菌株名为WB600 (pBE2-S-H)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0. 5757。一种枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法为是通过将肝素黄杆菌肝素酶I的编码基因转入枯草芽孢杆菌中，筛选得到的能够分泌表达肝素酶I的菌株。所述肝素酶I的编码基因如SEQ ID NO. 1或2所示，是公知技术，GenBank号分别为L12534. 1或ETO41216. 1。所述肝素酶I的编码基因5'-端连接有6XHis标签。具体构建步骤如下(1)利用Hind III和BamH I分别双酶切重组质粒&icB/pGEM -T fesy和质粒 PBE2，回收McB (H/B)和ρΒΕ2 (Η/Β)，将二者用Τ4 DNA连接酶连接；(2)连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组质粒PBE2-S，获得重组质粒PBE2-S ；(3)利用BamH I和EcoR I分别双酶切重组质粒H印A/pGEM _T fesy和质粒 PBE2-S，回收H印A (B/E)和质粒pBE2_S (Β/Ε)，将二者用T4DNA连接酶连接；(4)连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组表达质粒PBE2-S-H，最终获得重组表达质粒pBE2-S-H ；(5)以空质粒PBE2-S为阴性对照，利用电转化法将测序正确的重组表达质粒 PBE2-S-H转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，在卡那霉素抗性的LB平板上培养Mh，挑取阳性转化子单菌落扩增，提取重组质粒，进行质粒PCR验证，获得含pBE2-S-H的转化子 WB600 ；(6)发酵上述所得到的含PBE2-S-H的转化子WB600，鉴定产物并进行活性测定，得到一株能够高分泌表达肝素酶I的枯草芽孢杆菌工程菌，其肝素酶I活性达13000U/L发酵液，申请人对其进行了保藏，于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5757。优选的，所述步骤(5)中，电转化法的条件是电压2kV，电容25 μ F，电阻200 Ω， 电击时间4 5msο优选的，所述步骤(6)中，发酵的条件是37°C，200 220r/min培养Mh。优选的，所述步骤(6)中，鉴定产物的方法是通过SDS-PAGE进行的。本发明述的枯草芽孢杆菌工程菌，能够高分泌表达重组肝素酶I，分泌表达的重组肝素酶I具有较高的活性和产量，能够用于工业化生产低分子肝素、肝素的研究和临床用药。
枯草芽孢杆菌工程菌，菌株名为WB600 (pBE2-S-H)，分类命名为枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5757，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101。图1为重组表达质粒pBE2-S-H的构建过程示意图。图2为目的基因H印A PCR产物的电泳图，其中，泳道M为Ikb DNA ladder (10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)，泳道 1 为IfepAPCR产物。图3为&icB启动子和信号肽基因PCR产物的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker I (700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道 1 为 SacB 启动子和信号Jft基因
PCR产物。图4为载体pBE2-S的PCR验证的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker I (700bp、 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，泳道1 3为阳性转化子的PCR产物，泳道4为空质粒转化子的PCR产物。图5为重组表达载体pBE2-S-H的PCR及双酶切验证的电泳图，其中，泳道M为11Λ DNA ladder(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)， 泳道1 4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物，泳道6 9为阳性转化子的双酶切产物。图6为工程菌中表达载体pBE2-S-H的PCR验证的电泳图，其中，泳道M为11Λ DNA ladder (10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)，泳道 1 4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物。图7为工程菌WB600(pBE2-S-H)发酵液上清的SDS-PAGE图，其中，泳道M为低分子量蛋白质 Marker (94. OkD,66. 2kD、45. OkD,33. OkD,26. OkD,20. 0kD、14. 4kD)，泳道 1 为空白对照菌WB600 (pBE2-S)的发酵液上清，泳道2、3分别为工程菌WB600 (pBE2-S_H)诱导12h、 24h的发酵液上清。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1构建表达重组肝素酶I的枯草芽孢杆菌工程菌——枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)WB600(pBE2_S_H)。一、肝素黄杆菌肝素酶I基因的获得提取肝素黄杆菌DSMZ 2366基因组DNA，根据肝素酶I基因序列，设计一对引物Hl 和H2，进行常规聚合酶链式反应，扩增肝素黄杆菌肝素酶I基因序列，得到IlOObp的DNA片段(见图幻，产物扩增纯化后克隆到pGEM -T fesy载体上，构建成重组质粒H印A/pGEM -T Easy，序列测定结果表明，获得的肝素酶I基因序列与GenBank号为ETO41216. 1的5'-端第1-1089位碱基的核苷酸序列(SEQ ID NO. 2所示)完全一致。两条引物分别为Hl 5' CGGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3‘H2 5' CGGAATTC TTACTA TCTGGCAGTTTCGCTGT 3‘其中，Ll的5'-端加入限制性内切酶位点BamH I，L2的5'-端加入限制性内切酶位点EcoR I。二、含有肝素黄杆菌肝素酶I编码基因的表达载体PBE2-S-H的构建含有肝素黄杆菌肝素酶I编码基因的表达载体PBE2-S-H的构建过程参见图1描述。1、SacB启动子和信号肽序列的获得以枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA为模板扩增McB启动子和信号肽基因序列， SacB基因编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶，得到550bp的DNA片段(见图幻，产物扩增纯化后克隆到pGEM _T fesy载体上，构建成重组质粒&icB/pGEM -T Easy，序列测定结果表明，获得的&icB启动子和信号肽基因序列与GenBank号为X02730. 1的5'-端第1-550位碱基的核苷酸序列完全一致。两条引物分别为Sl 5' CGAAGCTTGATCCTTTTTAACCCATC 3‘S2 5' CGGGATCCCGCAAACGCTTGAGTTGC 3‘其中，Sl的5'-端加入限制性内切酶位点Hind III，S2的5'-端加入限制性内切酶位点BamH I。2、载体pBE2_S的构建将重组质粒&icB/pGEM -T Easy和质粒pBE2 (郭兴华，熊占，周民，等.枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建[J].生物工程学报，1991，7 C3) =224-229.)均利用 Hind III和BamH I双酶切，回收纯化McB (H/B)和ρΒΕ2 (Η/Β)，将二者用！"4 DNA连接酶连接，4°C反应过夜。感受态细胞的制备挑取单个大肠杆菌TGl (购自Sigma公司)菌落，接种于LB培养基3mL中，37°C培养12h，按1 100 二次接种于LB培养基50mL中，37°C培养池，待菌液 OD600 = 0. 35 时，4°C、5000r/min 离心 lOmin，弃上清，沉淀用 0. lmol/L CaCl2 悬浮，再以 5000r/min离心lOmin，弃上清，沉淀以适量0. lmol/L CaCl2悬浮，分装后于_80°C备用。连接产物的转化取上述连接产物加入大肠杆菌TGl感受态细胞50 μ L冰浴 30min, 42°C热击90s，迅速置冰浴2min，加入LB培养基lmL，37°C培养1. 5h，取菌液涂布于含氨苄青霉素(100yg/mL)的固体LB平板上培养，筛选得到具有氨苄青霉素抗性的转化子，提取转化子质粒后以Sl和S2为引物进行PCR验证。
结果如图4 所示，泳道 M 为 DNAMarker I (700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、100bp)，泳道1 3为阳性转化子的PCR产物，泳道4为空质粒转化子的PCR产物。 经PCR扩增鉴定，挑取的阳性转化子可扩增得到一条约550bp的单一条带，与McB启动子和信号肽基因的大小一致，而空质粒转化子经PCR后没有这一特异条带。这表明McB启动子和信号肽基因已经插入到质粒PBE2中。3、表达载体pBE2-S-H的构建将重组质粒！fepA/pGEM _TEasy和载体pBE2_S均利用BamH I和EcoR I双酶切， 回收纯化H印A(B/E)与pBE2-S(B/E)，将二者用T4DNA连接酶连接，4°C反应过夜。取上述连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞，筛选得到具有氨苄青霉素抗性的转化子，提取转化子质粒后以Sl和H2为引物进行PCR验证和BamH I /EcoR I双酶切验证。结果如图5 所示，泳道 M 为 Ikb DNA ladder (10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、 5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)，泳道1 4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物，泳道6 9为阳性转化子的双酶切产物。经PCR扩增鉴定，挑取的阳性转化子可扩增得到一条约1650bp的单一条带，与McB启动子和信号肽基因加H印A基因的大小一致，而空质粒转化子经PCR后没有这一特异条带。而且阳性转化子的双酶切产物得到两个条带，分别是约IlOObp的H印A(B/E)和约6. 7kb的pBE2_S(B/E)。这表明H印A 基因已经插入到质粒PBE2-S中。三、表达重组肝素酶I的枯草芽孢杆菌工程菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(pBE2-S-H)的构建1、工程菌 WB600(pBE2-S_H)的构建将E. coli TGl (pBE2-S-H)培养扩增，按照质粒小提试剂盒说明书，提取重组质粒 PBE2-S-H，最后用去离子水溶解质粒。将其电转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，在含硫酸卡那霉素(10yg/mL)的固体LB平板上培养，筛选阳性转化子。与此同时，以空载体 PBE2-S为阴性对照。具体方法是枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的制备挑WB600单菌落于LB培养基3mL中，37°C 振荡培养12h ；取过夜培养物2. 6mL于电转培养基(LB培养基+0. 5mol/L D-山梨醇)40mL 中，37°C振荡培养至OD600 = 0. 85 0. 95 ；收获菌液，冰浴lOmin，4°C、5000r/min离心5min 收集细胞；用预冷的电转缓冲液(0. 5mol/LD-山梨醇，0. 5mol/LD-甘露醇，10%甘油)50mL 重悬细胞，4°C,5000r/min离心5min，弃上清，如此漂洗4次；用1/40初始培养物体积的预冷电转培养基重悬细胞，使细胞终浓度为1 1. SXlOiciCfuAiL,分装后于-80°C备用。将感受态细胞置于冰上直至融化，轻轻振动EP管使之混勻，取WB600感受态细胞 60 μ L与重组载体DNA溶液1 8 μ L (50ng IOOng)混合，加入预冷的电转杯(Imm)中，冰浴aiiin后用电穿孔仪进行电转化，条件为电压2000V，电容25 μ F，电阻200 Ω，电击时间 4 5ms ο电击后立即加入复苏液(LB+0· 5mol/LD-山梨醇+0. 38mol/LD_甘露醇)lmL，混勻后转入无菌EP管中，37°C、100r/min，复苏3h。然后以12000r/min离心5min，弃上清，用复苏液200 μ L重悬细胞，涂布于含硫酸卡那霉素(10yg/mL)的固体LB平板上，37°C培养16 24h。挑取数个具有Kan抗性的转化子菌落，培养扩增后提取质粒(用溶液Pl重悬菌体后，加溶菌酶溶液使其终浓度为18mg/mL，37°C水浴lh，后续步骤按质粒小提试剂盒说明书)，以Sl和H2为引物进行质粒PCR验证。扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其大小是否正确。结果如图 6 所示，泳道 M 为 Ikb DNA ladder (10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、 5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)，泳道1 4为阳性转化子的PCR产物，泳道5为空质粒转化子的PCR产物。挑取的阳性转化子可扩增得到一条约1650bp的单一条带，与 McB启动子和信号肽基因加H印A基因的大小一致，而空质粒转化子经PCR后没有这一特异条带，说明重组表达载体PBE2-S-H已经转化成功。将工程菌WB600 (pBE2-S-H)和空白对照菌WB600 (pBE2_S)分别取50 μ L冻存菌种至LK (Kan终浓度为10 μ g/mL) 3mL中，37 °C、220r/min，振荡培养过夜。然后将菌液按 5 100转接至LK中进行扩大培养，约他后OD6tltl = 0.6 0.8时加入蔗糖，使其终浓度为 2%，继续培养Mh。以8000r/min离心收集发酵液，取2mL加入2倍冰冷无水乙醇中，于_20°C放置Ih 或更久，4°C、12000r/min离心lOmin，弃上清，沉淀用适量样品缓冲液溶解，沸水浴lOmin， 放冷后进行SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的分泌表达情况。电泳条件恒压90V，约0. 5h 后进入分离胶，调整电压至130V继续电泳，约池，待前沿迁移至胶板下沿Icm时结束电泳。 电泳结果如图7所示，泳道M为低分子量蛋白质Marker (94. OkD,66. 2kD、45. OkD,33. OkD、 26. OkD、20. OkD、14. 4kD)，泳道1为空白对照菌WB600 (pBE2_S)的发酵液上清，泳道2、3分别为工程菌WB600(pBE2-S-H)诱导12h、24h的发酵液上清。工程菌WB600 (pBE2-S_H)的发酵液上清在43. SkD有肝素酶I的特异条带，说明肝素酶I在WB600中实现了分泌表达。2、工程菌WB600 (pBE2-S_H)表达重组肝素酶I的活性测定重组工程菌WB600 (pBE2-S-H)的发酵液经8000r/min离心lOmin，收集上清，以备活性检测。活性测定采用Am法在2mL EP管中加入反应缓冲液500 μ L和待测液100 μ L， 置30°C水浴30min (以双蒸水100 μ L作为空白对照)，然后加入测定缓冲液900 μ L，立即测定A232，计算反应前后体系Am的变化值，即可计算肝素酶I的活性。酶活定义是以Imin内产生1 μ mol产物所需的酶量为一个单位。其中涉及的溶液配方是反应缓冲液(以mmol/ L 计)Tris-HCl(pH7. 4)20mmol，NaCl 44mmol, CaCl2 3. 5mmol，肝素 25g。测定缓冲液(以 mmol/L 计)Tris-HCl(pH7. 4)20mmol, NaCl 200mmol。结果测得重组工程菌WB600 (pBE2-S-H)发酵液中肝素酶I的活性为13000U/ L,远远高于文献 艮道(S. Ernst, G. Venkataraman, S. Winkler, et al. Expression in Escherichia coli, purification and characterization of heparinase I from Flavobacterium h印arinum[J]· Biochem. J，1996,315 :589-597.)的在大肠杆菌 BL21(DE3)中以可溶形式表达的3898U/L。申请人将该重组工程菌进行了保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0. 5757。本实验室也曾试图在乳酸菌表达系统中来表达肝素酶I，构建了含有肝素酶I的重组质粒PNZ8148-H，后转化乳酸乳球菌，使用NISIN进行诱导表达，但未见重组蛋白表达。 本发明通过枯草芽孢杆菌WB600不但成功实现了肝素酶I的重组表达，而且将发酵液酶活提高到了 13000U/L，取得了预料不到的酶活效果。需要注意的是，本发明的枯草芽孢工程菌的构建方法是有成功率的，也就是说，利用本发明的枯草芽孢工程菌的构建方法所得到的重组工程菌，并非都能够高效分泌表达肝素酶I，本发明的保藏的菌株，是发明人通过多次实验所得到的效果最好的重组工程菌，其发酵液酶活提高到了 13000U/L，远远高于其它通过同样的方法构建得到的工程菌。
权利要求
1.一株枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于菌株名为WB600(pBE2-S-H)，分类命名为 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5757。
2.一种枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于是通过将肝素黄杆菌肝素酶I 的编码基因转入枯草芽孢杆菌中，筛选得到的能够分泌表达肝素酶I的菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述肝素酶I的编码基因如SEQID NO. 1或2所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于所述肝素酶I的编码基因5'-端连接有6XHis标签。
5.根据权利要求2 4中任一项所述的构建方法，其特征在于步骤为(1)利用HindIII和BamH I分别双酶切重组质粒McB/pGEM _T Easy和质粒pBE2，回收McB (H/B)和ρΒΕ2 (Η/Β)，将二者用Τ4 DNA连接酶连接；(2)连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组质粒PBE2-S，获得重组质粒PBE2-S ；(3)利用BamHI和EcoR I分别双酶切重组质粒H印A/pGEM _T Easy和质粒pBE2_S， 回收H印A (B/E)和质粒pBE2-S (B/E)，将二者用T4 DNA连接酶连接；(4)连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组表达质粒PBE2-S-H，最终获得重组表达质粒pBE2-S-H ；(5)以空质粒PBE2-S为阴性对照，利用电转化法将测序正确的重组表达质粒pBE2-S-H 转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，在卡那霉素抗性的LB平板上培养Mh，挑取阳性转化子单菌落扩增，提取重组质粒，进行质粒PCR验证，获得含pBE2-S-H的转化子WB600 ；(6)发酵上述所得到的含PBE2-S-H的转化子WB600，鉴定产物并进行活性测定，若肝素酶I活性达13000U/L发酵液以上，即得到能够分泌表达肝素酶I的枯草芽孢杆菌工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述步骤(5)中，电转化法的条件是电压2kV，电容25 μ F,电阻200 Ω，电击时间4 5ms。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述步骤(6)中，发酵的条件是 37 0C，200 220r/min 培养 24h。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述步骤(6)中，鉴定产物的方法是通过SDS-PAGE进行的。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在生产肝素酶I中的应用。
10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在低分子肝素生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种表达重组肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757，其构建方法是将肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的编码基因转入枯草芽孢杆菌WB600中，得到能够分泌表达肝素酶Ⅰ的工程菌。本发明的枯草芽孢杆菌工程菌能够稳定高效地表达重组肝素酶Ⅰ，所述肝素酶Ⅰ能够特异性降解肝素和类肝素糖苷键，可用于工业化生产低分子肝素、肝素的研究和临床用药。
文档编号C12N15/75GK102533628SQ20121004286
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者周帅, 孙永福, 李娜, 李潇, 王凤山 申请人:山东大学