专利名称：一种含诺如病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及诺如病毒，具体说是一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
背景技术：
诺如病毒(Norovirus，NoV)是由美国学者Kapikin，首先于1972年采用免疫电镜方法，从发生于1968年在美国俄亥俄州诺沃克地区的一所学校暴发的胃肠炎病人的粪便标本中检出，并以发现地名称命名为诺瓦克样病毒(Norwalk — like virus，NLvS)。1995 年，国际病毒分类委员会第六次分类报告中正式将诺如病毒列入杯状病毒科、诺如毒属。诺如病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点。全年均可发生感染，常引起集体暴发，感染对象主要是学龄儿童和成人，本病的暴发大部分具有季节性，呈现秋冬季高发。诺如病毒是全球范围内引起人类急性胃肠炎的最重要的病原之一，可导致严重的食品安全和公共卫生问题。诺如病毒感染与世界上超过90%的病毒性腹泻相关。诺如病毒感染的流行特点1、低感染剂量(<10个病毒粒子)；2、较长的排毒时间 (viral shedding)，甚至病人在症状消失后仍可排出病毒，这增加了二次传播的风险；3、在较高的氯溶液和较宽的温度(冷冻_60°C )条件下依然保持稳定；4重复感染，可能是由于诺如病毒毒株之间缺乏交叉保护作用和缺乏长效免疫。根据外壳蛋白序列的不同，诺如病毒可以分为5个基因组(genogroups)，其中能感染人的病毒株属于GI、GII和GIV，总体来说，GII是优势毒株。其中，GII-4为优势基因型。20世纪80年代以前，诺如病毒的诊断方法主要有直接电镜法以及免疫电镜法、放射免疫法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)等。由于这些方法敏感性和特异性较低且材料来源有限， 很难广泛应用。自20世纪90年代以后，随着诺如病毒的全基因序列测序的完成，相继建立了多种灵敏、特异的诊断方法。(I)ELISA法。利用基因工程方法对诺如病毒株的重组衣壳蛋白进行表达，为诺如病毒的检测和血清流行病学研究提供了简便可行的方法。但由于不同株间衣壳蛋白抗原具有相当大的变异性，这降低了该法的特异性和敏感性，且材料来源有限，限制了该法的使用。(2)RT-PCR法。该方法是目前用于诺如病毒的最敏感、也是最广泛的检测方法。因为在检测后能够测序，所以在为确定感染源的分子流行病学研究和区别相似的暴发之间的连续时特别有用。最近，荧光定量RT—PCR由于具有灵敏和快速优势，被应用于胃肠炎暴发时大量粪便样品的检测。但由于病毒的变异和重组，针对特定毒株的引物和探针不能检测所有的毒株，常常导致漏检，所以能够检测所有毒株的引物和探针的设计就显得非常关键。由于诺如病毒潜在的传染性及其RNA的不稳定性，所以研制无传染性及稳定的质控标准品，对于诺如病毒RT-PCR试剂盒的研发具有重要意义。MS2噬菌体属于正性单链RNA球形病毒，基因组由3569个核苷酸构成，编码装配蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。噬菌体由180个包膜蛋白单体、1个成熟酶蛋白分子和一个基因组RNA组成。研究发现MS2噬菌体包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。如果将某一病毒RNA的cDNA连接于MS2噬菌体包膜蛋白基因cDNA下游，转录后将得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本，操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装成外壳，并将携带有某一病毒RNA序列的噬菌体基因组包装到包膜内，形成噬菌体病毒样颗粒。在实际构建质粒表达载体时，需将噬菌体装配蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆连接于表达载体启动子下游，这样，经过诱导表达后，所表达的包膜蛋白不仅作为病毒样颗粒的结构成分，而且可作为基因表达调节因子和Pac信号对表达过程进行调节，使包膜蛋白的表达和RNA的转录协调一致，此时，组装所得噬菌体样颗粒具有成熟特性，从而具有核糖核酸酶抗性。
发明内容
本发明针对上述问题提供一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法， 该病毒颗粒具有耐核糖核酸酶的特点，作为诺如病毒RT-PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性，易于保存和运输，对诺如病毒的基因诊断试剂盒的开发具有较强的实用价值。本发明一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒，由MS2噬菌体外壳蛋白包裹诺如病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；其内含有诺如病毒ORFl和0RF2之间保守基因区RNA序列，可表达诺如病毒G II -4型保守区基因，具有耐核糖核酸酶的特性。一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其具体制备步骤为 步骤一、pET-28b/MS2重组质粒的构建
1)根据GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列(NC_001417)，设计装配蛋白和包膜蛋白基因的引物MS2A和MS2B并进行人工合成，序列分别为MS2A 5 ‘ -ATCCATGGTCCTGCTC AACTTCCTGTCG-3 ‘ , MS2B 5 ‘ -GCGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3 ‘，下划线所指为上下游引物分别引入的Nco I和酶切位点；然后通过RT-PCR的方法扩增出装配蛋白和包膜蛋白基因(MS2基因)，其碱基序列如SEQ ID NO 3 ；
2)采用限制性内切酶AfcoI私B_H I分别双酶切装配蛋白和包膜蛋白基因和质粒 pET-28b(+)，采用胶回收试剂盒纯化后，通过T4 DNA连接酶将二者进行连接，得到连接产物；
3)将上述步骤2)所得到的连接产物转化导入大肠杆菌，挑阳性单克隆进行PCR和双酶切鉴定，确保重组质粒pET-28b/MS2构建的正确性，-20°C保存鉴定正确的重组质粒 pET-28b/MS2 ；
步骤二、pET-28b/MS2/NV重组质粒的构建
1)人工合成诺如病毒基因片段的正义链NVl和反义链NV2，其基因序列如序列表序列 4和序列5 ；分别在正义链的5 ‘端加入BamHl酶切位点，在反义链的5 ‘端加入Vi/^ III酶切位点；合成后取等摩尔量的正义链NVl和反义链NV2进行退火复性，置94°C水浴lOmin， 冷却至室温，使其退火为双链，制成诺如病毒基因片段，即NV基因，其碱基序列如SEQ ID NO :6。2)采用限制性内切酶及 /7 I和Hindi11分别双酶切重组质粒pET_2^/MS2和上述步骤1)所制备的诺如病毒基因片段；采用胶回收试剂盒分别纯化后，将二者用T4 DNA连接酶连接，得到连接产物；3)上述步骤2)说制备的连接产物转化导入大肠杆菌，挑阳性单菌落提取重组质粒， 分别进行PCR和三酶切鉴定，以确认pET-28b/MS2/NV重组质粒正确构建，并获得了含有 pET-28b/MS2/NV重组质粒的阳性菌落； 步骤三、诱导表达与纯化
将上述步骤二鉴定正确含有pET48b/MS2/NV重组质粒的阳性菌落，重新涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板，挑取单菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至 A600nm为0. 5 1. 0时，加入IPTG诱导后收集菌体；将收集后的菌体重新悬浮于TE溶液，力口入溶菌酶溶解细菌后，再加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶溶解DNA和RNA，采用聚乙二醇沉淀法进行操作，提取出的病毒样颗粒物，即为本发明含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒， 将其溶解于TE溶液，置于4°C储存。有益效果
本发明一种含诺如病毒RNA的病毒样颗粒，内含诺如病毒G II -4型保守区基因片段， 经试验验证该病毒样颗粒具有以下几个方面的优点1、无传染性，安全可靠，在制备和使用时对人员和环境没有危险；2、稳定性好，MS2病毒样颗粒具有耐RNA酶的特点，作为诺如病毒RT-PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性，易于保存和运输；3、对病原体内RNA 有很好的模拟作用；由于表达产物为噬菌体样颗粒，具有病毒颗粒特性，可以模拟病毒颗粒，全程监测实验过程，避免出现假阴性。本发明一种含诺如病毒RNA的病毒样颗粒可作为病毒检测的质控品和/或标准品，对于诺如病毒的基因诊断试剂盒的开发具有很强的实用价值。
图1是MS2 PCR产物电泳图；图中标号1为MS2 PCR扩增产物、M为DNA分子量标准。图2是pET48b/MS2质粒双酶切电泳图；图中标号1为pET48b/MS2双酶切、M为 DNA分子量标准。图3是重组质粒pET_28b/MS2/NV三酶切电泳图；图中标号1为重组质粒三酶切、M为DNA分子量标准。图4是病毒样颗粒的定性测定结果图；图中标号M为DNA分子量标准，1为阴性对照、2为阳性对照、3，4为反转录后扩增产物、5，6为无反转录直接扩增产物。图5是病毒样颗粒核糖核酸酶攻击试验结果图。图6是病毒样颗粒稳定性试验结果图。
具体实施例方式
本发明实施例涉及以下菌种、试剂和仪器
大肠杆菌MS2噬菌体(ATCC 15597B1)购于美国ATCC公司；pET_28b(+)质粒/大肠杆菌BL21 (DE3)菌株购于美国Novagen公司；大肠杆菌TGl菌株购于Stratagen公司；RNA提取试剂盒、质粒抽提纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、反转录酶M-MLV均为美国!Iomega 公司产品；限制性核酸内切酶及 /7 I ,Nco I和历^i/III购自大连宝生物生物工程公司、T4 DNA连接酶购自上海生工生物工程公司、Taq DNA聚合酶购于北京天根生化科技公司；引物和诺如病毒G II型保守区寡核苷酸片段由上海生工生物工程公司合成、PCR扩增操作使用美国ABI公司PE7700型荧光定量PCR仪。一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其具体制备步骤为 步骤一、pET-28b/MS2重组质粒的构建
1)根据GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列(NC_001417)，设计装配蛋白和包膜蛋白基因的引物MS2A和MS2B并进行人工合成，序列分别为MS2A 5 ‘ -ATCCATGGTCCTGCTC MCTTCCTGTCG-3 ‘ ,MS2B 5 ‘ -GCGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3 ‘，下划线所指为上下游引物分别引入的Nco I和酶切位点；然后通过RT-PCR的方法扩增出装配蛋白和包膜蛋白基因(MS2基因)，其碱基序列如SEQ ID NO 3 ；RT-PCR的方法扩增装配蛋白和包膜蛋白基因的具体方法为，首先配制反转录反应液，内含有IX反转录缓冲液、50U RNA酶抑制剂、 IOOU MLV反转录酶、50mmol N6随机引物，取MS2噬菌体RNA (采用RNA提取试剂盒按照其说明书进行提取后，加无菌超纯水按照水和RNA的体积比为100:1进行稀释)1 μ L作为模板，加入反转录反应液中，混勻，37°C孵育Ih后取2. 0 μ 1进行PCR扩增。PCR反应体系含 1. 5mmol/L MgCl2UOO μ mol/L dNTP、3U Taq DNA 聚合酶、10 μ L 反转录产物和引物 MS2A 和 MS2B 各 lOpmol，反应参数为 94°C预变性 300s，然后 94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 180s，;35 个循环后72°C延伸300s。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，得到与预期片段大小 (1. 7kb)相符的目的基因(如图1所示)；
2)采用限制性内切酶NcoI和BamH I分别双酶切上述步骤1)所获得的MS2基因和质粒pET48b(+)，采用胶回收试剂盒纯化后，通过T4 DNA连接酶将二者于16°C连接过夜，得到连接产物；
3)将上述步骤2)所得到的连接产物导入感受态细胞，涂布卡那霉素抗性的LB平板，37°C培养过夜后挑取阳性克隆，经菌落PCR鉴定与Afco I ,BamH I双酶切鉴定， 获得重组质粒pET-28b/MS2。MS2基因与载体pET_28b (+)重组后，重组质粒pET_28b/MS2 经Afco I私BamH I双酶切，电泳检测出现预期条带(如图2所示)。步骤二、pET-28b/MS2/NV重组质粒的构建
1)人工合成诺如病毒基因片段的正义链NVl和反义链NV2，其碱基序列如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO 5 ；分别在正义链的5 ‘端加入及丽酶切位点，在反义链的5 ‘端加入历‘/^111酶切位点；用双蒸水将诺如病毒G II型保守区基因片段NVl和NV2稀释为 100 μ mol/L,取等摩尔量的正义链NVl和反义链NV2混合后，置94°C水浴lOmin，然后缓慢冷却至室温，使其退火为双链，制成诺如病毒基因片段，即NV基因，其碱基序列如SEQ ID NO :6。2) pET-28b / MS2经限制性内切酶及 /7 I ,Hind III双酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收大片段，通过T4连接酶与NV基因连接获得pET-28b/MS2重组质粒与NV基因连接产物。3)上述步骤2)所制备的连接产物转化大肠杆菌BL21(DE!3)感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，37°C培养过夜，挑取单菌落接种到3mL LB培养基中37°C振荡培养过夜，提取重组质粒DNA，pET-28b/MS2/NV重组质粒经I、Nco I和历III三酶切后，切出MS2和131bp的NV片段(图3)。步骤三、诱导表达与纯化
将上述鉴定阳性的细菌，重新涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板，37°C培养过夜，挑取单菌落接种到3mL LB培养基中37°C振荡培养过夜，然后转接入IL含卡那霉素的LB 液体培养基中，37°C振荡培养至A6tltlnm为0. 5 1. 0时，加入IPTG至终浓度为0. 4mmol/L,继续培养证，离心收集菌体。将菌体悬浮于TE溶液中，加入溶菌酶至10mg/L，室温放置20min， 离心去除沉淀，向上清液加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I，使两者终浓度均为lmg/L， 37°C温育30min后按照分子克隆实验指南(第三版)[Μ].科学出版社，2002版中的聚乙二醇沉淀法进行操作，提取出的病毒样颗粒物，即为本发明含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒， 将其溶解于TE溶液中，置于4°C储存。步骤四、病毒样颗粒的鉴定实验 1)PCR鉴定实验
取表达、纯化的12ml病毒样颗粒悬浮液，进行106、107、IO8UO9倍稀释，一组不经过反转录直接进行PCR反应；另一组样本反转录后，再进行PCR扩增，电泳检测扩增结果。样本稀释后，其中一组不经过反转录直接进行PCR反应，检测结果均为阴性(图4中第5、6泳道)，表明制备病毒样颗粒悬浮液中和病毒样颗粒内，均没有DNA模板污染；另一组样本反转录后，再进行PCR扩增，检测结果为阳性(图4中第3、4泳道)，表明诺如病毒GII型保守区基因片段已经重组于病毒样颗粒中，而且模板以RNA形式存在。2 )病毒样颗粒核糖核酸酶攻击试验
取病毒样颗粒IO6倍稀释度标本20份，各50 μ 1，每10份一组。一组直接进行样品处理、反转录和荧光定量PCR扩增。另一组加入lmg/L的核糖核酸酶，室温放置60min再进行样品处理、反转录和荧光定量PCR检测，比较两组的Ct值。结果如图5所示，用核糖核酸酶处理病毒样颗粒，与未处理对照组(各10份)，平行进行RNA提取、反转录和荧光定量PCR检测，两组检测结果基本一致，表明制备的病毒样颗粒能够抵抗核糖核酸酶的降解作用。3)病毒样颗粒稳定性实验
取病毒样颗粒IO6倍稀释度标本，分别于37°C放置5d、10d、15d、20d、25d、30d，然后进行样品处理、反转录和荧光定量PCR检测，比较其Ct值的变化。病毒样颗粒的稳定性实验结果如图6所示，37°C放置不同时间后的Ct值变化趋势表明，制备的病毒样颗粒在37°C至少可以储存30天，稳定性较好。本发明所述的大肠杆菌MS2噬菌体，为普通大肠杆菌MS2噬菌体，可通过市场购买得到，例如可从美国ATCC公司、北京北纳创联生物技术研究院等购买；
所述的pET18b(+)质粒为原核表达载体，可通过市场购买得到； 所述的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，大肠杆菌TGl菌株为普通大肠杆菌，均可通过市场购买得到；
所述的TE溶液的组成成份每升三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有 IOmmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量为水，pH值为7. 5 ；
所述的LB固体培养基的组成成份按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠，1. 8%的琼脂，余量为水；
所述的LB液体培养基的组成成份按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、3%的氯化钠，余量为水。
权利要求
1.一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于其具体制备步骤为步骤一、pET-2mVMS2重组质粒的构建1)设计PCR扩增MS2噬菌体的MS2基因的引物，并进行人工合成，其序列分别为上游引物5，-ATCCATGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCG-3’,下游引物5’ -GCGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3’,下划线所指为上下游引物分别引入的Afco I私BernH 酶切位点；然后通过RT-PCR的方法扩增出MS2基因，其碱基序列如 SEQ ID NO 3 ；2)采用限制性内切酶AfcoI和BernH I分别双酶切MS2基因和质粒pET_28b (+)，纯化后进行连接，得到连接产物；3)将上述步骤2)所得到的连接产物转化导入大肠杆菌，挑阳性单菌落进行PCR和双酶切鉴定，确保重组质粒pET-28b/MS2构建的正确性，-20°C保存鉴定正确的重组质粒 pET-28b/MS2 ；步骤二、pET-28b/MS2/NV重组质粒的构建1)人工合成诺如病毒NV基因片段的正义链NVl和反义链NV2，其碱基序列如SEQID NO 4和SEQ ID NO 5 ；分别在正义链的5，端加入B棚// I酶切位点，在反义链的5，端加入Viz7i/III酶切位点；取等摩尔量的合成后的正义链NVl和反义链NV2加入同一个PCR管， 混合均勻后置于94°C水浴lOmin，冷却至室温，使其退火为双链，即合成了 NV基因；2)采用限制性内切酶及 /7I和历ii/III分别双酶切重组质粒pET-28b/MS2和上述步骤1)所制备的NV基因片段，纯化后进行连接，得到连接产物；3)上述步骤2)所制备的连接产物转化导入大肠杆菌，挑阳性单菌落提取重组质粒， 分别进行PCR鉴定和三酶切鉴定，以确认pET-28b/MS2/NV重组质粒正确构建，并获得含有 pET-28b/MS2/NV重组质粒的阳性菌落；步骤三、诱导表达与纯化将上述步骤二鉴定正确含有pET-28b/MS2/NV重组质粒的阳性菌落，重新涂布于含卡那霉素的LB平板，培养后挑取单菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至A6tltlnm 的检测值为0. 5 1. O时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，使其终浓度为0. 4mmol/ L,继续培养5h，离心收集菌体；将菌体悬浮于TE溶液中，加入溶菌酶，使其终浓度为IOmg/ L，室温放置20min，离心去除沉淀，向上清液加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I，使两者终浓度均为lmg/L，37°C水浴1小时溶解DNA和RNA，然后采用聚乙二醇沉淀法进行操作，提取出的病毒样颗粒物，即为本发明含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒，将其溶解于TE缓冲液，置于4°C储存。
2.如权利要求1一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于所述的MS2基因为可表达MS2噬菌体装配蛋白和包膜蛋白的基因。
3.如权利要求1一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于所述的NV基因片段的序列为G II -4型诺如病毒基因序列最保守的ORFl和0RF2的交界区的 131碱基，其碱基序列如SEQ ID NO :6。
4.一种用权利要求1所述方法制成的含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒，其特征在于含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒是由MS2噬菌体外壳蛋白包裹诺如病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；其内含有G II -4型诺如病毒ORFl和0RF2之间保守基因区RNA序列，可表达诺如病毒G II -4型保守区基因，具有耐核糖核酸酶的特性。
全文摘要
一种含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法，该假病毒颗粒是由MS2噬菌体外壳蛋白包裹诺如病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体，RNA-蛋白复合体的形状为球状；设计并人工合成引物通过PCR的方法得到目的基因MS2，将其连接到质粒pET-28b(+)上得到重组质粒pET-28b/MS2，将所得重组质粒pET-28b/MS2与NV片段连接得到pET-28b/MS2/NV重组质粒，将所得pET-28b/MS2/NV重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达，采用聚乙二醇法沉淀病毒样颗粒，所得病毒样颗粒即为含诺如病毒RNA片段的假病毒颗粒。本发明的假病毒颗粒可作为RT-PCR检测的标准品和质控品，无传染性，安全可靠、稳定性好，具有耐核糖核酸酶的特点。
文档编号C12N15/40GK102559616SQ20121004368
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者冯艳铭, 李智涛, 白永杰, 董璠, 高秀菊 申请人:河南科技大学