专利名称：一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法及专用酿酒酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高酵母分泌表达异源蛋白的方法，尤其是针对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白的方法及专用提高酿酒酵母异源蛋白分泌表达的菌株。
背景技术：
近年来，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主菌表达异源蛋白日益引起重视，酿酒酵母作为低等真核生物具有非致病性，快速分裂，容易培养，基因操作简单等优势，并且具备将异源蛋白进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，然而，仍然存在很多瓶颈如低分泌效率和过度糖基化等，制约了异源蛋白在酿酒酵母中的分泌表达。影响异源蛋白分泌效率的主要因素有目的蛋白本身的性质，密码子偏好性，载体，启动子，信号肽，蛋白质合成、折叠和分泌过程，受体菌和培养条件(Niebauer RT and Robinson AS, In Baneyx F(ed)Protein expression technologies. Horizon, Norwich ;2005 :253-296.)。在这些影响因素中蛋白质合成、折叠和分泌过程有可能是限速步骤。在内质网腔中，分子伴侣和助折叠因子促进蛋白质加工折叠成正确的结构，是限速步骤之一，有研究报道过表达内质网分子伴侣或者非折叠应答途径(UPR)的组分可以促进蛋白分泌(Ji L et al.,Bioresour Technol 2011,102(17) :8105-8109 ；Ilmen M et al.，Biotechnol Biofuels2011，4:30)。另外一个限速步骤是蛋白质运输过程，有许多研究结果表明敲除介导高尔基体到囊泡的蛋白质误分拣途径的囊泡蛋白分拣受体义-VPSlO基因，可以促进异源蛋白分泌(Hong E et al.，J Cell Biol 1996,135 :623-633 ；Holkeri H and Makarow Μ, FEBSLett 1998,429 :162-166 ；Zhang B et al.，J Cell Biol 2001，153 :1187-1198)；另外过表达参与高尔基体产生的分泌小泡与质膜融合的t-SNARE基因&-SS01，可以提高异源蛋白分泌表达(Ruohonen L et al.，Yeast 1997,13(4) :337-351 ；Larsson S et al.，ApplEnviron Microbiol 2001,67(3) :1163-1170)。纤维素乙醇是有潜力的未来燃料，纤维素乙醇的生产需要纤维素水解微生物和糖发酵微生物的协作。CBP (Consolidated bioprocessing)是将纤维素酶和半纤维素酶生产、纤维素水解和乙醇发酵过程组合或部分组合，通过一种微生物完成。CBP过程有利于降低生物转化过程的成本，越来越受到研究者的普遍关注。一个成功的CBP菌株不仅需要强有力的乙醇发酵能力，还需要纤维素水解能力。作为传统的乙醇生产菌株，酿酒酵母被认为是良好的 CBP 载体(Lynd LR et al. ,Microbiol Mol Biol Rev 2002,66(3) :506-577.)。构建酿酒酵母CBP菌株的主要策略是在酿酒酵母中高效分泌表达木质纤维素水解酶(Lynd etal. , Microbiol Mol BiolRev 2002,66(3) :506-577)。纤维素降解至少需要三种，内切葡聚糖酶(或称1，4-β -D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，EC3. 2. 1.4，通常用EG来代表)和外切葡聚糖酶(包括1，4-β-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶，EC3. 2. 1.91，用CBH来代表，和1，4-β-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶，EC 3.2. 1.74)和β-葡萄糖苷酶(或称为纤维二糖酶，β-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，EC 3.2. 1.21，常用BGL来代表)(Kar 1-Erik Eriksson et al. , In :Springer series in wood science. Berlin/Heidelberg, New York :Springer_Verlag ; 1990.)。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶协同作用产生纤维二糖和一些纤维寡糖，进而葡萄糖苷酶水解产生葡萄糖，其中，外切葡聚糖酶对降解微晶纤维素是必需的。丝状真菌瑞氏木霉Hypocrea jecorina(即Trichodermareesei的有性型)是最强大的纤维素酶生产菌株之一，瑞氏木霉纤维素酶系统至少由两种外切葡聚糖酶、至少六种内切葡聚糖酶和两种β-葡萄糖苷酶组成，其中Tr_Cel7A(CBH I)是瑞氏木霉产生的主要纤维素酶，可以水解固体纤维素，并占瑞氏木霉所分泌纤维素酶的60% (Nidetzky B and Claeyssens Μ, Biotechnol Bioeng 1994,44 :961-966 ； Stahlberg J,1991, PhD Thesis, Uppsala University，Sweden)，据文献报道iTr-CePA从纤维素的还原端连续水解纤维素链(Barr B Hsieh et al.，Biochemistry 1996,35(2) :586-592 ；Divne Cet al.，J Mol Biol 1998,275(2) :309-325 ；Nutt A et al.，Eur J Biochem 1998,258(1)200-206·)。Tr-Cel7A 含有 513 个 AA (Shoemaker S et al. , Biotechnology (N. Y.) 1983,1 691-696)，在催化结构域有10个二硫键，在底物结合结构域含有2个二硫键(Guochao Wuet al.，World J Microbiol Biotechnol2010, 26 :323-328.)，另外在催化结构域还含有 4个潜在的N-糖基化位点，蛋白质相对分子量偏大，结构相对比较复杂，这就为其在酿酒酵母中异源表达增加了难度，很多研究表明在酿酒酵母中分泌表达的重组Tr_Cel7A同样存在分泌效率低(Ilmen M et al. ,Biotechnol Biofuels 2011，4 :30)，过度糖基化(PenttilaME et al.，Gene 1988，63(1) :103-112 ；Den Haan R et al.，Enzyme Microb Tech 2007，40 :1291-1299.)等问题，有必要对酿酒酵母菌株进行改造，提高其对外源蛋白的分泌表达能力。目前，针对提高酿酒酵母分泌表达体系的方法的研究多集中在单纯改造参与蛋白质合成分泌途径一个或两个蛋白，产生的效果有一定局限，而且对异源蛋白还表现出蛋白质特异性。因此，需要对异源蛋白本身结构进行分析，有针对性的对酿酒酵母蛋白质分泌途径进行多重遗传修饰改造，以获得更高效的酿酒酵母异源蛋白分泌表达菌株。
发明内容
针对上述现有技术不足，本发明要解决的问题是提供一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白尤其是针对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白的方法及专用提高酿酒酵母异源蛋白分泌表达的菌株。本发明所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，步骤是(1)宿主菌改造以单倍体双缺菌株 CEN. PK102-3A(Entian KD and Kotter P,Method Microbiol 1998,26 =431-449.)为出发酿酒酵母菌株，利用Cre-IoxP系统敲除P-型Ca2+/Mn2+AIPase基因&-PMR1和蛋白质误分拣途径受体基因&-VPS10，通过构建整合型表达载体PYMIKP-SS01-PDI1实现二硫键异构酶基因&-PDI1和质膜t_SNARE基因Sc-SSOl在基因组上的过表达，获得对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的重组酿酒酵母菌株BSXOlO ；(2)分泌表达载体构建以PJFE2为空质粒构建重组质粒pJCF，获得包含有异源蛋白的分泌表达载体；(3)重组菌株构建将步骤( 构建的分泌表达载体分别转化到出发酿酒酵母菌株CEN.HQ02-3A和步骤(1)所得重组酿酒酵母菌株BSX010中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即建立表达异源蛋白的常规菌株(为&-PMR1和&-VPS10基因未被敲除，Sc-PDIl和&-SS01基因未被过表达的酿酒酵母菌株)和待检测菌株；(4)菌株培养对步骤( 所述常规菌株和待检测菌株分别进行常规培养，收集菌液；(5)酶活测定将上述分别收集的菌液离心，取上层培养液进行异源蛋白胞外酶活测定；(6)判断以对常规菌株测定的异源蛋白胞外酶活值为基准，判定待检测菌株异源蛋白的分泌表达是否得到提高。上述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中步骤(2)所述空质粒为pJFE2 (Peng B et al.，Metab Eng 2012，14(1) :9-18.)，该质粒以 YCplac33 (Gietz andAkio, Gene 1988,74 :527-534.)为骨架，引入TEFl启动子-PGKl终止子和TDHl启动子-CYCl终止子。上述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中步骤C3)所述转化优选采用醋酸锂转化法。上述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中步骤C3)所述筛选得到转化成功的转化子的方式优选为用添加20g/L葡萄糖的含有200 μ g/mlG418的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura筛选正确的转化子。本发明阐述的提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，通过敲除P-型Ca2+/Mn2+ATPase基因&-PMR1，可以促进蛋白质折叠；通过敲除蛋白质误分拣途径受体基因&-VPS10，可以减少异源蛋白被蛋白质误分拣途径误分拣到液泡中降解；通过过表达二硫键异构酶基因&-PDI1，可以促进二硫键的形成；通过过表达质膜t-SNARE基因&-SS01，可促进蛋白质运输过程中分泌小泡与质膜t-SNARE的结合，与传统的酿酒酵母分泌表达体系优化方法(单重修饰改造)相比，本发明对酿酒酵母宿主菌的蛋白质合成分泌途径，进行了多重修饰改造，尤其针对大分子量二硫键丰富的异源蛋白分泌表达有促进作用。本发明所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法中专用的提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，其特征在于该菌株是一株对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5748。本发明所述提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株BSX010的菌学特征为CEN. PK102-3A derivative ；ΜΑΤ αura3-52 leu2_3112 ；vpslOΔ，pmrlΔ，Sc-SSOl,k-PDIl，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，在固体或液体的复合培养基(YPD，该培养基是现有技术中已有的)并且添加200 μ g/ml G418的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白色。实验证实本发明提供的重组酿酒酵母菌株BSX010与常规的酿酒酵母菌株相比较，该菌株能使大分子量二硫键丰富的瑞氏木霉来源的外切葡聚糖酶(Tr-Cel7A)的胞外酶活提高2. 56倍。
本发明涉及的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BSX010,已于 2012 年 02 月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5748。本发明涉及的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BSXC10,已于 2011 年 12 月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5657。图1 :PCR扩增带有筛选标记基因的&-VPS10基因的同源重组片段SC_VPS10基因重组臂l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。其中1 Sc-VPS 10基因重组臂1 ； 2 Sc-VPS 10基因重组臂2 ； 3 Sc-VPS 10基因重组臂 l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂 2 ；M Ikb DNA Ladder。图2 :PCR扩增带有筛选标记基因的&-PMR1基因的同源重组片段Sc_PMRl基因重组臂 l-loxP_KanMX4-loxP-重组臂 2。其中1 Sc-PMRl基因重组臂1 ；2 Sc-PMRl基因重组臂2 ；3 Sc-PMRl基因重组臂l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂 2 ;M :lkb DNA Ladder。图3 =PCR验证&-VPS10基因和&-PMR1基因被正确敲除的转化子。其中1 以敲除&-VPS10基因的转化子为模板，用引物VPSLl和引物VPSL4，扩增VPSlO基因同源重组臂之间的基因片段；2 以敲除&-VPS10基因的转化子为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段；3 以敲除&-PMR1基因的转化子为模板，用引物PMRLl和引物PMRL4扩增PMRl基因同源重组臂之间的基因片段；4 以敲除Sc-PMRl基因的转化子为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段。图4 =PCR验证G418筛选标记被丢失的转化子。其中1 以&-VPS10基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物VPSLl和引物VPSL4，扩增&-VPS10基因同源重组臂之间的基因片段；2 以&-VPS10基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段；3 以Sc-PMRl基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物PMRLl和引物PMRL4，扩增&-PMR1基因同源重组臂之间的基因片段；4 以&-PMR1基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段。图5 =PCR扩增带有BamH I酶切位点的&-PDI1基因片段。其中1 =BamH I-PDIl 基因片段；M :lkb DNA Ladder。图6 =PCR扩增带有BamH I酶切位点的&-SS01基因片段。其中M Ikb DNALadder ；1 =BamH I-SS01 基因片段。图 7 =Bgl II 酶切线性化 ρYMIKP。其中M Ikb DNALadder ；1 =BglII 酶切的 ρYMIKP。图 8 =PCR 扩增 BamH I-PGKlp-PDIl-PGKlt 基因片段以及 BamH I 酶切pYMIKP-SSOl。其中1 :BamH I-PGKlp-PDII-PGKlt 基因片段；M Ikb DNALadder ；2 =BamH I 酶切的 pYMIKP-SSOl。图9 过表达&-PDI1和&-SS01基因使用的重组质粒pYMIKP_SS01_PDIl构建过程。图10 :PCR验证&-PDI1基因是否整合到基因组上。其中1 :PDII-PGKt 基因片段；M :lkb DNALadder。图11 :PCR验证&-SS01基因是否整合到基因组上。其中1 SSOl-PGKt 基因片段；M Ikb DNALadder。图 12 =XbaI 酶切 Tr_cel7A。1 =XbaI 酶切的 Tr_cel7A ；M :lkb DNALadder。图 13 =XbaI 酶切 pJFE2。1 =XbaI 酶切的 pJFE2 ；M :lkb DNA Ladder。图14 分泌表达I~r-Ce17A基因使用的重组质粒pJCF。图15 =PCR验证重组细胞中含有Tr_cel7A基因。其中1 :Tr_cel7A ；M Ikb DNALadder。图16 重组酵母BS)(C10产生的胞外Tr_Cel7A酶活测定。其中▲:BSXC00 (pJFE2) ；· =BSXCOl (Tr-cel7A) ；· =BSXClO (vpslO Δ , pmrl Δ ,Sc-SSOl, Sc-PDIl, Tr-cel7A)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1 参与蛋白运输过程的蛋白质误分拣途径受体基因&-VPS10的敲除方法如下(I)PCR扩增&-VPS10基因的重组臂以酿酒酵母CEN. PK102-3A基因组为模板，用引物VPSLl和引物VPSL2，扩增得到200bp的重组臂1 (图1)，用引物VPSL3和引物VPSL4，扩增得到200bp的重组臂2 (图1)；其中，上述VPSL1、VPSL2、VPSL3和VPSL4引物序列为
VPSLl :5’ -ACAGCATGATGCAACAGCT-3’
VPSL2 :5’ -TATTAAGGGTTGTCGACCTGCACTTCAGGGCTTTTCCA--3，
VPSL3 :5’ -TGATATCAGATCCACTAGTGTAGATAATTCCATATACTTTT-3’
VPSL4 :5’ -CCGTAACATATGATATATCC-3，
PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ Μ)
IOXTaq Buffer (含 Mg2+)5微升；
dNTP Mixture(各 2. 5mM)4微升；
引物 VPSLl 和 VPSL2 (或 VPSL3 和 VPSL4)各1微升；
模板DNA1微升；
Taq DNA聚合酶0. 5微升；
灭菌蒸馏水补至50微升；
PCR反应条件94°C预变性10分钟，94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分
钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。胶回收纯化浓缩&-VPS10基因的重组臂1和
重组臂2。 Q)PCR扩增带有筛选标记基因的同源重组片段以步骤(1)得到的重组臂1 和重组臂 2 以及质粒 pUG6 (GUldener U et al. Nucleic Acids Res 1996,24(13)2519-2524.)为模板，用引物VPSLl和引物VPSL4，通过融合PCR扩增得到1984bp的两端带有重组臂以及带有IoxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段Sc-VPS10基因重组臂l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂 2 (图 1)；其中，上述VPSLl和VPSL4引物序列为VPSLl :5’ -ACAGCATGATGCAACAGCT-3’VPSL4 5’ -CCGTAACATATGATATATCC-3 ’PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ M)10 X Taq Buffer (含 Mg2+)5 微升；dNTPMixture (各 2. 5mM)4 微升；引物VPSLl和VPSL4各1微升；模板DNA1微升；Taq DNA 聚合酶0. 5 微升；灭菌蒸馏水补至50微升；PCR反应条件94°C预变性10分钟，94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。胶回收纯化浓缩同源重组片段Jc-VPSIO基因重组臂l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。(3)同源重组片段转化敲除&-VPS10基因转化25微升步骤(2)得到的基因片段&-VPS10基因重组臂l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2转化酿酒酵母CEN. PK102-3A,通过含200 μ g/ml G418的YPD O % glucose)平板筛选转化子；G) PCR验证酿酒酵母转化子提取步骤(3)所得转化子的基因组，以基因组为模板，用引物VPSLl和引物VPSL4以及Kanlox-up和Kanlox-down，PCR扩增得到1984bp的同源重组臂之间的基因片段和1584bp的G418抗性基因片段(图3)；其中，上述Kanlox-up禾口 Kanlox-down弓丨物序列为Kanlox-up :5， -CAGGTCGACAACCCTTAAT-3，Kanlox-down :5’ -CACTAGTGGATCTGATATC-3’PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ M)10 X Taq Buffer (含 Mg2+)5 微升；dNTPMi xture (各 2. 5mM)4 微升；引物 VPSLl 和 VPSL4 (或 Kanlox-up 和 Kanlox-down)各 1 微升；模板DNA1微升；Taq DNA 聚合酶0. 5 微升；灭菌蒸馏水补至50微升；PCR反应条件94°C预变性10分钟，94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。(QCre重组酶表达载体转化转化25微升质粒pSH47 (GUldener U et al. NucleicAcids Res 1996,24(13) :2519-2524.)到步骤(4)验证正确的重组转化子，用SC-Ura平板筛选转化子；(6) Cre重组酶诱导表达将步骤( 所得重组子在液体YPD中培养过夜，收集菌体，用无菌水洗涤两次，将菌体接入YPG培养基galactose)培养步骤( 所得转化子2h诱导表达Cre重组酶，将诱导培养液涂布于YPD平板分离单菌落；
(7)筛选G418抗性筛选标记去除菌落将步骤(6)所得单菌落分别点于无G418YPD平板和含200μ g/ml G418 YPD平板，在YPD平板上生长并且在含G418 YPD平板上不生长的转化子即为G418抗性筛选标记去除菌落；(8) PCR验证Cre-IoxP重组的重组子提取步骤(7)所得G418抗性筛选标记去除菌落的基因组，以基因组DNA为模板，用引物VPSLl和引物VPSL4，PCR扩增得到400bp的片段(图4)，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，PCR不能扩增到G418抗性基因，验证后得到
正确发生Cre-IoxP重组的重组子；PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ Μ)10 X Taq Buffer (含 Mg2+)5 微升；dNTPMixture (各 2. 5mM)4 微升；引物 VPSLl 和 VPSL4 (或 Kanlox-up 和 Kanlox-down)各 1 微升；模板DNA1微升；Taq DNA 聚合酶0. 5 微升；灭菌蒸馏水补至50微升；PCR反应条件94°C预变性10分钟，94 °C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。(9)5-F0A丢失质粒pSH47 将步骤(8)所得重组子在液体YPD中转接培养过夜，划线于5-F0A培养基平板筛选去除质粒PSH47，最终得到酿酒酵母菌株BSX002。实施例2 位于高尔基体膜上P-型Ca2VMn2+AIPase基因&-PMR1的敲除方法如下(I)PCR扩增&-PMR1基因的重组臂以酿酒酵母CEN. HQ02-3A基因组为模板，用引物PMRLl和引物PMRL2，扩增得到200bp的重组臂1 (图2)，用引物PMRL3和引物PMRL4，扩增得到200bp的重组臂2 (图2)；其中，上述VPSL1、VPSL2、VPSL3和VPSL4引物序列为
PMRLl :5’ -TGTTCCCTAGGCCATCGT-3’
PMRL2 :5’ -TATTAAGGGTTGTCGACCTGACACTTAAGCTTACGTCTG--3，
PMRL3 :5’ -TGATATCAGATCCACTAGTGTCGTTTTTCCTTCCTTCCC--3，
PMRL4 :5’ -TCTAGTCCGGAAAAAGAAG-3，
PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ Μ)
IOXTaq Buffer (含 Mg2+)5微升；
dNTPMixture(各 2. 5mM)4微升；
弓 I 物 PMRLl 禾口 PMRL2 (或 PMRL3 禾口 PMRL4)各1微升；
模板DNA1微升；
Taq DNA聚合酶 0. 5微升；
灭菌蒸馏水补至50微升；
PCR反应条件94°C预变性10分钟，94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分
钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。胶回收纯化浓缩&-PMR1基因的重组臂1和
重组臂2。 O)PCR扩增带有筛选标记基因的同源重组片段以步骤(1)得到的重组臂1和重组臂2以及质粒pUG6为模板，用引物PMRLl和引物PMRL4，通过融合PCR扩增得到1984bp的两端带有重组臂以及带有IoxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段Jc-PMRl基因重组臂 l-loxP-KanMX4-loxP-重组臂 2 (图 2)；其中，上述PMRLl和PMRL4弓丨物序列为PMRLl :5，-TGTTCCCTAGGCCATCGT-3，PMRL4 5' -TCTAGTCCGGAAAAAGAAG-3，PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ M)10 X Taq Buffer (含 Mg2+)5 微升；dNTPMixture (各 2. 5mM)4 微升；引物PMRLl和PMRL4各1微升；模板DNA1微升；
Taq DNA 聚合酶0. 5 微升；
灭菌蒸馏水补至50微升；PCR反应条件94°C预变性10分钟，94 °C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。胶回收纯化浓缩同源重组片段Sc-PMRl基因重组臂 l-loxP_KanMX4-loxP-重组臂 2。(3)同源重组片段转化酿酒酵母以敲除&-PMR1基因转化25微升步骤( 得到的基因片段&-PMR1基因重组臂l-l0XP-KanMX4-l0XP-重组臂2到实施例1所得酿酒酵母BSX002中，通过含200 μ g/ml G418的YPD (2% glucose)平板筛选转化子；G) PCR验证酿酒酵母转化子提取步骤C3)所得转化子的基因组，以基因组为模板，用引物PMRLl和引物PMRL4以及Kanlox_up和Kanlox_down，PCR扩增得到1984bp的同源重组臂之间的基因片段和1584bp的G418抗性基因片段(图3)；其中，上述Kanlox-up禾口 Kanlox-down弓丨物序列为
Kanlox-up :5’ -CAGGTCGACAACCCTTAAT-3’
Kanlox-down :5’ -CACTAGTGGATCTGATATC-3’
PCR反应体系如下(引物浓度为10 μ Μ)
IOXTaq Buffer (含 Mg2+)5微升；
dNTPMixture(各 2. 5mM)4微升；
引物 PMRLl 和 PMRL4 (或 Kanlox-up 和 Kanlox-down)各1微升；
模板DNA1微升；
Taq DNA聚合酶0. 5微升；
灭菌蒸馏水补至50微升；
PCR反应条件94°C预变性10分钟，94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分
钟，30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。(5)Cre重组酶表达载体转化转化25微升质粒pSH47到步骤(4)验证正确的重组转化子，用SC-Ura平板筛选转化子；(6) Cre重组酶诱导表达将步骤( 所得重组子在液体YPD中培养过夜，收集菌体，用无菌水洗涤两次，将菌体接入YPG培养基galactose)培养步骤( 所得转化子2h诱导表达Cre重组酶，将诱导培养液涂布于YPD平板分离单菌落；
(7)筛选G418抗性筛选标记去除菌落将步骤(6)所得单菌落分别点于无G418YPD平板和含200μ g/ml G418 YPD平板，在YPD平板上生长并且在含G418 YPD平板上不生长的转化子即为G418抗性筛选标记去除菌落；(8) PCR验证Cre-IoxP重组的重组子提取步骤(7)所得G418抗性筛选标记去除菌落的基因组，以基因组DNA为模板，用引物PMRLl和引物PMRL4，PCR扩增得到400bp左右的片段(图4)，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，PCR不能扩增搭配G418抗性基因，验证后得到正确发生Cre-IoxP重组的重组子；
权利要求
1.一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，步骤是(1)宿主菌改造以单倍体双缺菌株CEN.HQ02-3A为出发酿酒酵母菌株，利用Cre-IoxP系统敲除P-型Ca2+/Mn2+ATPase基因&-PMR1和蛋白质误分拣途径受体基因&-VPS10，通过构建整合型表达载体pYMIKP-SSOl-PDIl实现二硫键异构酶基因&-PDI1和质膜t-SNARE基因Sc-SSOl在基因组上的过表达，获得对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的重组酿酒酵母菌株BSXOlO ；(2)分泌表达载体构建以PJFE2为空质粒构建重组质粒pJCF，获得包含有异源蛋白的分泌表达载体；(3)重组菌株构建将步骤( 构建的分泌表达载体分别转化到出发酿酒酵母菌株CEN. HQ02-3A和步骤(1)所得重组酿酒酵母菌株BSX010中，并通过筛选得到转化成功的转化子，即建立表达异源蛋白的常规菌株和待检测菌株；(4)菌株培养对步骤( 所述常规菌株和待检测菌株分别进行常规培养，收集菌液；(5)酶活测定将上述分别收集的菌液离心，取上层培养液进行异源蛋白胞外酶活测定；(6)判断以对常规菌株测定的异源蛋白胞外酶活值为基准，判定待检测菌株异源蛋白的分泌表达是否得到提高。
2.如权利要求1所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，其特征在于步骤(3)所述转化采用醋酸锂转化法。
3.如权利要求1所述提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，其特征在于步骤(3)所述筛选得到转化成功的转化子的方式为用添加20g/L葡萄糖的含有200μ g/naG418的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura筛选正确的转化子。
4.一株提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，其特征在于该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BSX010,已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5748。
全文摘要
本发明公开了一种提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白的方法，是通过宿主菌改造、分泌表达载体构建、重组菌株构建、菌株培养、酶活测定，实现提高酿酒酵母分泌表达异源蛋白尤其是分子量大且二硫键丰富的异源蛋白。本发明还提供了所述方法中专用的提高异源蛋白分泌表达的重组酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。
文档编号C12R1/865GK102559740SQ201210044319
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月25日 优先权日2012年2月25日
发明者徐丽丽, 沈煜, 鲍晓明 申请人:山东大学