专利名称：一种同时鉴别食品中四种肉类成分的多重pcr方法
技术领域：
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及应用通用引物多重PCR法对食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的同时快速检测方法及其应用。
二.
背景技术：
肉和肉制品掺杂掺假是我国食品质量控制面临的重要挑战之一。不法企业在利益的驱使下使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉制品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。传统的依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要，因此，对于我国肉制品市场占有率较高的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉，建立科学、准确快速高通量筛选方法已十分必要。以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品中肉类种属鉴定的核心方法。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来， 实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。在目标基因选择方面，动物线粒体基因组DNA序列具有高度的物种特异性，且由于拷贝数多而在食品加工过程不完全降解，因此其多态性位点是设计肉类成分定性检测的首选靶点。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，所建立的PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，且进入了国内权威的检测技术标准。在实际检测中，尤其需要对大量的食品样本进行肉类掺假的筛选时，提高检测效率与通量对于及时监管十分重要。以多重PCR为基础，建立多种肉类成分同时鉴别的快速检测技术是提高效率的有效途径之一。然而目前，针对我国肉类掺假现状，应用多重PCR的肉类快速同时鉴别与筛选技术尚未见报道。
三.
发明内容
本发明需要解决的问题是根据动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，利用正向引物共用、反向引物特异的策略，建立用于猪、牛、羊、鸡4种肉类DNA快速检测的通用引物多重PCR体系，通过电泳检测扩增产物分子量大小对物种加以鉴别，可在同一反应体系中实现4种肉类成分的同时检测。首先，通过对多种常用动物基因组DNA提取方法的比较选择高效稳定的肉制品中总DNA提取方法；然后，基于动物线粒体细胞色素b基因的特异性位点，设计多重PCR引物；接着，进行多重PCR检测方法优化及特异性、灵敏度考察；最后，应用此方法对80份食品盲样进行检测以验证其实用价值。本发明中，基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，设计5条长度不同的通用引物多重PCR引物，其中鸡、牛、羊、猪的产物片段分别为216bp、263bp、320bp和387bp，建立并优化多重PCR反应体系，通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别。本发明的技术方案包括1.分别使用DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的总DNA，产物测定于260nm 和280nm处的吸光度值，计算DNA浓度和纯度，比较提取效率和纯度，确定提取肉类中总DNA 的方法。2.设计并合成多重PCR的引物。3.多重PCR检测反应条件及优化。4.针对提取的动物基因组总DNA进行多重PCR检测，考察方法的特异性与灵敏度。5.对大量食品样品进行盲样检测。I.分别使用DNeasy试剂盒、经典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取猪、 牛、羊、鸡4种肉类的总DNA。表I列出了应用3种方法对生鲜肉提取的结果。SDS-蛋白酶 K法与DNeasy试剂盒法所提取的DNA浓度处于同一个数量级，SDS-蛋白酶K法在浓度与纯度方面均略优。CTAB-蛋白酶K法由于对肌肉组织消化效果较差，因此DNA提取效率显著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法，DNeasy试剂盒大大节省了提取时间，且无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂，综合考虑提取速度与效率，后续实验中均采用DNeasy试剂盒提取食品中的总 DNA。表I 3种DNA提取方法的比较Table I Comparison of three DNA extraction methods
权利要求
1.一种同时快速鉴别食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的通用引物多重PCR方法，其特征是由以下步骤构成(1)使用DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒提取基因组总DNA；(2)基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，采用正向引物共用、反向特异性引物的策略设计5条通用引物多重PCR引物，建立并优化多重PCR反应体系，通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速同时鉴别，多重PCR的反应体系为PCR反应 50 μ L 体系反应缓冲液(10Χ ) 5μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4μ L, MgCl2 (2. 5mmol/L) 3μ L, Taq酶0.5 μ L，正向引物与4条反向引物(10 μ mol/L)各I μ L，模板2 μ L，反应条件为 940C 3min，30 个循环的 94°C >30s, 52°C >30s, 72°C >45s, 72°C >7min0
2.根据权利要求I所述同时快速鉴别食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的通用引物多重PCR方法，其特征在于正向引物序列为5’-CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3’，反向特异性引物序列分别为鸡 5’-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3’，牛 5’-CTAGAAAAGTGTAAGACC CGTAATATAA-3，，羊 5，-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-3，，猪 5，-GCTGATAGTAGATTTGTGATG ACCGTA-3’，鸡、牛、羊、猪的特异性扩增产物片段分别为216bp、263bp、320bp和387bp。
3.权利要求I所述的同时快速检测食品中猪、牛、羊、鸡四种肉类成分的通用引物多重 PCR方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。
全文摘要
本发明属于食品质量安全检测技术领域。具体涉及通过动物基因组DNA提取、引物设计和通用引物多重PCR方法(Universalprimers-multiplexPCR，UP-M-PCR)对食品中猪、牛、羊、鸡4种肉类成分进行同时快速检测。根据动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点，利用正向引物共用、反向引物特异的策略，应用包含5条引物的通用引物多重PCR体系实现4种肉类成分的同时快速鉴别，结果表明，以上方法具有良好的针对该四种目标肉类成分的特异性，检出限可达到皮克级，且反应体系各组分未见交叉干扰。对市场上肉制品随机抽取80份食品样检测验证鉴别方法的准确性。总之，本发明建立了特异、灵敏、实用的食品中4种常见肉类成分快速筛选的多重PCR方法。
文档编号C12Q1/68GK102605090SQ20121009965
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者何玮玲, 周骏贵, 张驰, 杨军 申请人:南京市产品质量监督检验院