专利名称：OsDLS1基因在调控水稻叶片衰老及抽穗期方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水稻整体生长发育情况改进技术领域，涉及对于水稻的育种、品种改良的研究工作，更具体地说是HD-Zip III家族成员OsDLSl基因，及其该基因在调控水稻叶片衰老及抽穗期方面的应用。
背景技术：
我国是世界上最大的稻米生产国和消费国，水稻产量直接关系到我国粮食安全，因此提高水稻产量对确保我国农业持续稳定发展和社会稳定有十分重要的战略意义。我国在杂交水稻超高产育种中已取得了重大突破，杂交水稻产量大幅度提高。但是杂交水稻尤其是亚种间杂交水稻容易早衰，使籽粒充实度差(袁隆平1990)。植物的衰老是外界环境和基因网络共同作用的结果，是植物内基因程序性表达的结果。在不良外界环境的影响下，水稻叶片常会发生较早的衰老，叶片过早的变黄枯萎，从而使水稻营养生长不良，造成其生殖器官灌浆不盈，空秕粒增多，大大影响了水稻的产量。由于水稻叶片是水稻最主要的绿色器官之一，是水稻进行光合作用产生营养物质最主要的器官，水稻叶片早衰常引起库源关系转化紊乱，营养物质的产生及运输受阻，从而造成水稻减产。另外，水稻叶片早衰造成细胞结构过早的不合时宜的崩解，内膜系统破坏，大分子物质降解等使整个植株衰亡。因此，从水稻中分离衰老调控途径中重要的功能基因，深入研究其功能，弄清其在水稻叶片衰老过程中的调控途径，研究水稻叶片衰老的机理，发展和完善水稻叶片衰老调控网络，有利于解决水稻生长后期的早衰问题，对于进一步提高水稻产量，减少因不良环境而导致的水稻产量的损失，为水稻的分子育种提供设计方案，确保粮食安全具有重要的意义。另外，水稻的抽穗期是水稻的一个重要农艺性状，我国从低纬度海南地区Γ22° N，短日照热带地区)到高纬度东北黑龙江地区Γ 45° N，长日照寒冷地区)都有栽培稻分布，甚至在黑河Γ 50° N)也有少量分布(徐文霞，1999)。栽培稻如此宽广的分布与水稻的一个重要农艺性状一抽穗期的适应性紧密相关，即水稻在长期的栽培驯化过程中，在人工选择条件下，一些适应当地环境条件的变异品种保存下来，使得其能在当地条件下抽穗开花，并得到推广应用。因此对水稻抽穗期适应性的分子机理研究可以为水稻的驯化历史及水稻未来的适应性推广提供新的证据和洞察力，对于水稻的育种、品种改良提供科学依据。植物叶片对植物的生长发育至关重要，它可以通过光合作用将光能及CO2转化成植物可以利用的有机化合物，以供其本身及植物其它组织器官的生长发育。近年来，水稻叶片过早衰老导致水稻减产引起了国内的重视，一些研究者从植物生理的角度进行了研究，例如低浓度的Ca2+能提高叶片中叶绿素含量和蛋白质含量，提高过氧化物酶活性，延缓叶片的衰老进程(朱诚等2002);另外，通过降低库源比，能减缓杂交水稻叶片中蛋白质含量和叶绿素含量的下降(段俊等1997)。虽然国内外在生理生化方面已有数十年的研究，但对于植物叶片衰老的基因调控网络仍不清楚和完善。正常生长条件下，植物叶片衰老是一个主动的过程。植物叶片衰老主要由叶龄信息控制的，当叶片发育成熟并达到一定的叶龄后，叶片细胞自动启动衰老程序。虽然植物叶片的衰老主要是由内在基因控制的一个主动过程，但其仍然受外界环境的影响。诱发植物衰老的外界因素主要包括一些生物及非生物胁迫。生物因素主要表现病虫害的侵染，当植物受到病虫伤害后，一方面，植物会启动自我保护机制，表现出一种超敏反应，从而诱发植物衰老。实际上，植物所产生的这种超敏反应也是一种细胞程序性死亡(Van Doorn,2005)。诱发植物叶片衰老的非生物因素包括机械损伤、干旱、高温高热、及氧化胁迫等。这些非生物胁迫常与不同激素途径(乙烯、ABA、JA等调控途径)相互作用调控植物器官的衰老，例如向日葵中，HD-Zip转录因子家族成员ΗΑΗΒ4转录因子在病虫侵蚀、机械损伤及水分胁迫条件下表达量迅速上升。另外，当用乙烯或茉莉酸甲酯MeJA处理时，ΗΑΗΒ4的转录水平也迅速增加。过量表达胡挪￥基因的转基因植株在用机械伤害处理前后，JA和乙烯的含量都增加了，表明ΗΑΗΒ4正向调控JA和乙烯的合成量，从而正向调控植物叶片的衰老(Manavella et al. 2008)。
植物叶片衰老首先从叶尖或叶缘开始向叶的中间及基部蔓延,叶片逐渐变黄枯萎至整个叶片脱落死亡。在叶片衰老的进程中，最明显的变化就是叶绿素的降解。最近通过几个滞绿突变体已在拟南芥和水稻中鉴定出几个调控叶绿素降解的功能基因。复旦大学蒯本科研究组利用模式植物拟南芥鉴定了一个调控植物绿色器官衰老进程中叶绿素降解的一个关键基因JiMSY (Ren et al. 2007)，揭示了植物在衰老进程中，植物叶片光合作用的主要物质叶绿素如何被程序性降解。水稻基因是从水稻滞绿突变体中克隆得至Ij, A7C7 是光系统 II (PSII)中 LHCPII (light-harvesting complex II )的组成部分,负责叶绿素的降解(Kusaba ei a7. 2007)。在突变体中，在植物叶片衰老期，叶绿素不能正确降解，从而使突变体叶片在衰老时期仍然表现绿色。Sato等(Sato et al. 2009)报道了一个类似突变体/707，该突变体表型与相似，叶绿素在成熟期能维持较长时间，叶绿体基粒片层结构在成熟衰老期也保持稳定。双突变体能持久抑制叶绿素的降解。另一个水稻滞绿突变体5·#叶片与野生型植株相比，在衰老后期能维持更长时间的绿色，延迟了叶片衰老。过表达5 明显加速了叶片叶绿素的降解，叶片呈现棕黄色表型，表明5 正向调控水稻叶片衰老(Park et al. 2007)。Jiang等(Jiang et al. 2007)也报道了一个从水稻滞绿突变体5·#中克隆的基因5 ，该基因编码一个推断的叶绿体转运肽，在正常生长条件下表现组成型低丰度表达，但在黑暗诱导或者ABA处理条件下，表达水平增加，而在细胞分裂素CTK处理条件下表达水平下降。过量表达该基因加速了水稻叶片的衰老，表明该5 可以正向调控水稻叶片衰老。植物衰老常受植物激素调控，植物激素在叶片衰老的各个时期都起作用，乙烯对于植物叶片衰老具有正向调控作用，增加乙烯含量可以加速植物叶片衰老。北京大学郭红卫研究组系统的研究了植物激素乙烯调控植物叶片衰老的信号转导途径，并揭示出不同植物激素通过交互作用共同调控植物叶片的衰老(Chen etal. 2009; Zhong et al. 2009,2010)。Jing等报道了将乙烯信号转导与叶龄依赖的衰老途径整合在一起的调控途径，并利用拟南芥o7o7of leaf death I)突变体克隆出了这一调控途径中的关键基因OLDl。给oldl突变体施加外源乙烯则会加速早期叶片衰老，表明OLDl负向调控乙烯在叶龄依赖叶片衰老中的作用(Jing et al. 2005)。细胞分裂素(Cytokinin，CTK)对于延缓植物的衰老具有重要的作用。细胞分裂素主要在根部合成，通过木质部转移到植物其它部分起作用。Kim等(Kim et al. 2006)利用拟南芥功能获得性突变体克隆获得了CTK受体基因AHK3,发现其在CTK介导的叶片衰老调控中起关键作用。一些受体激酶也被鉴定涉及植物叶片衰老，南开大学王宁宁研究组鉴定了一个大豆受体激酶基因命说版，过表达该基因加速了大豆叶片的衰老进程，表明该基因涉及大豆叶片衰老调控(Li et al. 2006)。这些受体激酶是WARK转录因子的靶标，与调控WARK转录因子相互作用共同调控叶片衰老(Robatzek et al. 2002)。另外,植物叶片衰老受光条件的诱导及叶片中糖浓度的调节，拟南芥己糖激酶基因/Ζ 7是一个典型的受光照强度调控植物叶片衰老的基因，该基因从葡萄糖不敏感突变体中克隆得到，当外源葡萄糖浓度达到6%时，野生型植株生长发育停滞，而仍能正常生长。在正常光照条件下，野生型和突变体叶片表现正常生长，然而，在高光照强度处理下，野生型植株叶片迅速衰老变黄，
突变体植株虽减少了生长量,但其叶片衰老延迟,叶色浓绿(Moore et al. 2003)。表明HXKl通过整合外部光照信号和内在基因信号而调控植物的衰老。
发明内容
本发明的目的在于提供HD-Zip III家族成员OsDLSl基因及其应用。本发明的上述目的是通过如下的方法予以实现
HD-Zip III家族成员OsDLSl基因的核苷酸序列为SEQ ID No. I所示，OsDLSl编码一个855个氨基酸的蛋白质序列为SEQ ID No. 2所示。本发明所述HD-Zip III家族成员OsDLSl基因的mRNA序列为SEQ ID No. 3所示。本发明进一步公开了 HD-Zip III家族成员《5规分基因及蛋白质在制备调控水稻叶片衰老及水稻抽穗期方面的应用。本发明的实验结果表明
(I)HD-Zip III家族成员OsDLSl基因可以调控水稻叶片的衰老，当OsDLSl基因功能丧失或下降后，加速了水稻叶片的衰老，当OsDLSl基因功能上调(过表达)后延缓了水稻叶片的衰老。(2)0sDLSl基因可以促进水稻在长日照条件下的抽穗，当OsDLSl基因功能丧失或下降后，水稻在长日照条件下的抽穗期推迟。
图I OsDLSl转录因子结构域及其亚家族成员；其中A =OsDLSl转录因子结构域；B :水稻中HD-ZIP III亚家族成员同源关系；
图2 RNAi转基因植株的表型；其中A =RNAi转基因植株的表型。RNAi转基因植株叶片首先叶尖变黄，叶片中下部出现锈斑，之后锈斑扩展至整个叶片，最终使叶片枯萎死亡。B =RNAi转基因植株目的基因表达检测，CK为空载体转基因植株。C 'OsDLSl的同源基因在RNAi转基因植株中的表达；
图3过表达转基因植株的表型；其中A :过表达转基因植株的表型。当野生型植株叶片开始干枯时，过表达转基因植株叶片还处于完全绿色，未表现出干枯。B :过表达转基因植株目的基因表达检测，WT为野生型中花11，ονΓονδ为过表达转基因植株；
图4 OsDLSl在不同组织中的表达；其中A ,OsDLSl在叶、第二节间茎、穗下茎、幼穗、成熟花器官及幼嫩分生组织中的表达。B ,OsDLSl在叶不同发育时期的表达。
具体实施例方式 为了更充分的解释本发明的实施，提供HD-Zip III家族成员OsDLSl基因的制备实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的试剂均有市售。实施例I
I植物材料粳稻品种中花11 (有市售)(Oryza sativa L. ssp. Japonica)用于本实验中。
方法
2. I RNAi载体的构建
我们构建了两个RNAi载体，一个干涉区段位于5’ -UTR区，另一个干涉区段位于3’ -UTR区。用于构建RNAi载体的两个干涉区段从水稻基因组DNA中扩增得到，所用引物序列为:RNAi-3，UTR: IHDl :5，-CACCATCCATGGTTTCCAG-3，和 IHD2:5’ -GGTAACTCAATGCCGATTGC-3’。 RNAi-5’ UTR: IHD3: 5’- CACCGGTCGAGAGA GAAAGT-3’和 IHD4: 5’-TCCTCCTCGTCGCTGCTTGT-3’。扩增好的片段用 pENTR Directional TOPOCloning Kits (Invitrogen, USA)根据说明书上的程序构建到目的载体pANDA35HK中，通过酶切及PCR方法鉴定正确的克隆用农杆介导的方法转化水稻材料中花ll(Hiei et al.1994)。PCR 扩增条件为1 min / 95°C ; 30 cycles (30 sec / 94°C，30 sec / 59°C，30 sec / 72 °C ) ; 5 min / 72。。。反应体系如下(总体积20 μ L)
DNA10 - 30ng
10 X Buffer (含 20 mM Mg2+)2 μ L
dNTP (2. 5mM)0. 2mM
PrimerF (IHD1/IHD3)0. 2 μ M
PrimerR (IHD2/IHD4)0. 2 μ M
ExTaq 酶(TaKaRa)I U
ddH20 补至20 μ L
2.2过表达载体的构建
带有完整ORF的OsDLSl基因的cDAN从15天大小的水稻幼苗中通过RT-PCR方法获得，在引物设计中引入和feci两个酶切位点用于与载体中相应酶切位点连接。扩增的引物序列为0SHDF:5’ -ATGACCCGGGCGAGTTCTTGCTGGGTTGTTG-3> 和 OSHDR: 5’ -TTGCGAGCTCACGGTGGTGGTATTCAGGTCT -3’。连接后转化大肠杆菌 DH5 a (TaKaRa,大连)，通过酶切鉴定和PCR鉴定后，阳性克隆进行测序分析，测序正确的载体用农杆菌介导的方法转化中花 11。PCR 扩增条件为1 min / 95°C ; 35 cycles (30 sec / 95°C，30 sec /63°C，3min / 72°C ) ; 5 min / 72°C。反应体系如下(总体积20 μ L)
cDNAI μ L
10 X Buffer (含 20 mM Mg2+)2 μ LdNTP (2. 5mM)0. 2 mM
OSHDF0· 2 μ M
OSHDRO. 2 μ M
Phusion Taq (NEB)IU
ddH20 补至20 μ L
2.3 As规分基因在不同组织器官中的表达
为了分析也规分基因在水稻不同组织器官中的表达情况，水稻叶片、茎、幼穗、成熟花器官及幼嫩分生组织被收集，总RNA用TRIzol (Invitrogen, USA)试剂提取后用DNaseI (Invitrogen, USA)处理消化基因组DNA。Mg的总RNA用M-MLV反转录酶(TaKaRa,Dalian, China)反转录合成cDNA。合成的cDNA用OsDLSl基因的特异引物进行PCR反应扩增，以水稻OsActinl做内参相对分析基因的表达。基因表达特异引物序列为FDF: 5’- CACCACGCGACTTTTGGACT-3’和 FDR: 5’- GGAGATTCATAGAGCGGTCG-3’。扩增程序为 I min / 950C ; 30 cycles (30 sec / 94°C , 30 sec / 59°C , 30 sec / 72°C);
5min / 72。。。2. 4 flsjZ分在RNAi及过表达转基因植株中的表达分析
为了检测RNAi及过表达转基因植株的干涉效果及过表达效果，总RNA从40天大小的转基因植株及其对照的叶片中提取后用DNase I (Invitrogen, USA)处理消化基因组DNA。I Kg 的总 RNA 用 M-MLV 反转录酶(TaKaRa, Dalian, China)反转录合成 cDNA。反转录好的 cDNA 用于 RT - PCR 或 Real-time PCR 模板。Real-time PCR 按照 SYBR GreenPCR master mix (Tiangen, Beijing, China)试剂盒说明操作，在 Stratagene Mx3000P Thermal System (STRATAGENE, USA) PCR仪上进行扩增反应。所用引物序列同2. 3所用的序列。每个反应进行3次重复，并用水稻OsActinl作为内参相对定量分析，数据分析采用 Livak 描述的 2_ΔΔα 方法进行(Livak et al. 2001)。Real-time PCR 扩增条件为2min / 950C ；40 cycles (20 sec/ 95°C，30 sec/ 59°C，30 sec/ 68°C )。结果分析
3.I OsDLSl基因结构及亚家族分析
OsDLSl编码一个855个氨基酸的蛋白质，含有4个结构域，其中Homeobox和bZIP所构成的HD-ZIP结构域在该转录因子中起重要作用(图1A)。特异的DNA序列可以与HD-ZIP中的结合域结合而对其它的基因起调控作用。水稻中，HD-Zip III亚家族有5个成员，它们的同源关系如图IB所示，其中OsDLSl与0sH0X32亲缘关系最近，氨基酸序列同一性高达87%。As规分与其它植物的HD-Zip III亚家族成员的同源性也很高，与已知的拟南芥的ATHB9.ATHB14和ATHB15的氨基酸同一性也都在65%以上。表明该转录因子亚家族的氨基酸序列非常保守。OsDLSl RNAi转基因植株获得及其表型分析
为了探索该转录因子的功能，我们采用反向遗传学方法构建了 RNAi和过表达载体，将其导入到中花11中。两个RNAi载体共获得了 108株TO代转基因阳性植株(61株RNAi5 ’ -UTR，47株RNAi3 ’ -UTR)，但未见明显表型。随机选取20个RNAi5 ’ -UTR TO代植株和12个RNAi3’ -UTR TO代植株播种获得Tl代植株，20个RNAi5’ -UTR Tl株系中有8个株系有表型，开始植株叶片上表现锈斑，之后斑块扩大曼延至整个叶片，最终使叶片枯萎死亡(图2A)。12个RNAi3’ -UTR Tl代株系中有2个株系有表型，与RNAi5’ -UTR表型略有不同，植株叶片首先叶尖变黄，叶片中下部出现锈斑，之后锈斑扩展至整个叶片，最终使叶片枯萎死亡(图2A)。将有表型植株挂牌取样，提取RNA，用RT-PCR方法检测目的基因的表达，发现在RNAi转基因植株中，As规分的表达与对照相比明显降低，表明RNAi的确干扰了OsDLSl基因的表达(图2B)。单株收种种植获得纯合的T2代转基因植株用于后续研究。Tl代RNAi转基因植株在2011年分别在天津(长日照地区，"39° N)和海南Γ22° N)种植，统计RNAi转基因植株的抽穗期发现，RNAi转基因植株在天津种植的抽穗期比对照推迟了 35天，而在海南种植的抽穗期比对照推迟了 6天。由于两个地区田间种植的光周期和温度都不同，我们在实验室人工气候箱控制条件下种植(LD :14h光照，10 h黑暗；SD 10h光照，14 h黑暗；温度都为28°C )RNAi转基因植株及对照，统计抽穗日期发现在短日照条件下转基因植株和对照基本同时抽穗，但在长日照条件下转基因植株的抽穗期推迟了 40天以上。这一结果表明该转录因子在长日照条件下可以促进水稻的抽穗。为了检测所构建的RNAi载体干涉了 HD-ZIP III亚家族其它成员，我们用RT-PCR 检测了与《S规分同源的几个基因在RNAi转基因植株中的表达，结果表明RNAi3’ UTR载体很特异，不能干涉其它HD-ZIP III亚家族成员，但RNAi5’UTR载体可以干涉6( 基因，但不能干涉其它4个成员(图2C)。这可能也是两个构建的RNAi载体所获得的转基因植株表型略有不同的原因。OsDLSl过表达转基因植株获得及其表型分析
过表达载体共获得68株TO代植株，其中42株为转基因阳性植株。阳性转基因植株中有6株叶片表现延迟衰老，并且穗及花器官表现畸形(图3A)。其余植株没有明显表型差另Ij。单株挂牌取样提取RNA，用RT-PCR方法检测目的基因的表达，过表达转基因植株As规分基因的表达的表达明显增强(图3B)。OsDLSl在不同组织中的表达分析
为了检测OsDLSl在水稻不同组织中的表达情况，收集野生型不同时间和不同组织材料，分离RNA，反转录后用RT-PCR分析目的基因在水稻不同组织中的时空表达特性，结果表明OsDLSl在水稻不同组织中均有表达，但在幼嫩的分生组织和幼穗中的表达量较高，在成熟的花器官中表达量较低(图4A)。整个生育期分都表达。为了检测As规分在水稻叶片不同发育时期的表达，用实时定量PCR方法分析了幼嫩的叶片(15天幼苗叶片)、成熟叶片(60天植株剑叶)及衰老的叶片(叶片开始变黄)今OsDLSl的表达情况，结果表明在幼嫩的叶片中表达量较高，而在衰老叶片中的表达量较低(图4B)，表明该转录因子在幼嫩的组织中表达量较高，随着组织的衰老表达量下降。OsDLSl 基因序列(SEQ ID No. I 所示) AAATAAGAAACAACGAGACTCTTGATGTACCAAGCCGAGTCTGAAGAAGAGAAAAGAGAGAGAGTTCAGAAA
AAGGAAACGACCCTATTCTGATCAGAAAAATTCAATCTTTCTCTCTCTTTCTCTCAGAAAAGGTCGAGAGAGAAAGT
GGATGTCTTCATGTGAAGACCAGAGAGAAGACGAGAGGCGATCGCAGTGGAGTGGAGTGAAGTACTAGCAGTATTAA
AACCAGCAGCAAGCGAGAGAGAGGCCACCAACCACTTCCTCCTCCAAGAAACCACCCCCACCACGAGCACGAGCACG
AGCAACCATGGCGGTGGCAGAGGGAGCTGCGACTGCGAGCTACGGGCCATGACTGCGGCGAGTTCTTGCTGGGTTGT
TGTTGTACAAGCAGCGACGAGGAGGAGGGGAGCAGAGGAGGAGGAGGCGGAGGGATGGCAGCGGCGGCGGTGGGGGG
AAGGGGGGAGAGGCTGTCGTCCTCCTCCCCGACGGCGGCGGCGCCGCAGGTGGACGCCGGGAAGTACGTCCGGTACA
权利要求
1.HD-Zip III家族成员OsDLSl基因的核苷酸序列，其特征在于OsDLSl基因的核苷酸序列为SEQ ID No. I所元、，OsDLSI编码ー个855个氨基酸的蛋白质序列为SEQ ID No. 2所/Jn o
2.权利要求I所述HD-ZipIII家族成员OsDLSl基因的mRNA序列为SEQ ID No. 3所/Jn o
3.权利要求I或2所述HD-ZipIII家族成员As规分基因在制备调控水稻衰老及水稻抽穗期方面的应用。
全文摘要
本发明涉及HD-ZipIII家族成员OsDLS1在调控水稻衰老及抽穗期方面的应用。其中HD-ZipIII家族成员OsDLS1基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，OsDLS1编码一个855个氨基酸的蛋白质，序列为SEQIDNo.2所示。OsDLS1基因的mRNA序列为SEQIDNo.3所示。本发明公开的OsDLS1基因的核苷酸序列对于进一步提高水稻产量，减少因不良环境而导致的水稻产量的损失，为水稻的分子育种提供设计方案，确保粮食安全具有重要的意义。
文档编号C12N15/29GK102851299SQ201210123259
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者栾维江 申请人:天津师范大学