专利名称：一种新的l-山梨糖/l-山梨酮脱氢酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，尤其是一种全新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因。
背景技术：
维生素C，又称抗坏血酸，作为人体必需的一种维生素和抗氧化剂，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，2-KLG是合成维生素C的重要前体。最早实现维生素C工业化生产的工艺是德国Reichstein于1934年发明的所谓“莱氏法”，包括五步化学反应和一步生物转化将葡萄糖转化为2-KLG，再经酯化生成维生素C。但该法存在能耗高、消耗大量有机溶剂、环境污染严重等缺点，与“莱氏法”相比，尹光琳等发明的二步发酵法具有工艺流程简单、生产周期短、成本低廉等优点。在这一过程中，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖，L-山梨糖转变为2-KLG的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)组成,其中K. vulgare为产酸菌,单独培养时生长微弱,产酸较少；B. megaterium为伴生菌,不产酸,但促进K. vulgare生长或产酸。Ketogulonigenium sp.是Urbance等人与2001年定义的一个新属，其分类学位置为变形菌门(Proteobacteria), a -亚纲(Alpha proteobacteria),红细菌目(Rhodobacterales),红细菌科(Rhodobacteraceae)。在变形菌门中，已经有954株微生物进行了基因组序列测定。在K. vulgare所在的红细菌科中已有34株微生物进行了基因组序列测定并公布，主要包括红细菌属(8株)、Rueqeria属(8株)、玫瑰杆菌属(8株)，这些测序的结果将会在进化关系分析及代谢网络构建中发挥重要作用。
发明内容
本发明中以江苏江山制药有限公司提供的维生素C工业生产菌株K. vulgareWSH-OOl为研究对象，利用焦磷酸测序为基础的454GS FLX高通量测序法结合传统的Sanger shotgun测序技术进行序列测定，得到一种新的同时编码L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的双功能基因，在国内外文献中未见报道，为一种新的分子。本发明要解决的技术问题是提供一种L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，可以用来构建高产2-KLG的工程菌，简化维生素C的生产工艺。所述L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，核苷酸序列如以下I)或2)所示I)其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示核苷酸序列；2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因编码的蛋白质也是本发明要求保护的范围。
含有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因的转基因细胞系或基因工程菌也属于本发明要求的保护范围。含有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因的表达载体或克隆载体也属于本发明要求的保护范围。利用本发发明提供的基因构建基因工程菌的方法为I)根据本实验室对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh序列设计引物克隆sdh/sndh ；2)将sdh/sndh与pET28a(+)质粒连接得到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21后得到重组菌株。下面是本发明技术方案的具体描述质粒及重组菌的构建 将本实验室对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh序列扩增后连接到克隆载体PMD19-T vector上，将构建好的克隆载体转化E. coli JM109后对转化子进行菌落PCR(PCR引物5’ -3’ :GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC;CCCAAGCTTTTATTGCGGCAGGGCGAAGACGTAGA,下同)，验证阳性转化子(含有1737bp条带)，证明pMD19-T_sdh/sndh已经被转化到E. coli中，挑取阳性转化子培养并提取质粒测序，将测序正确的转化子提取质粒，经双酶切后回收sdh/sndh片段连接到质粒pET28a(+)上构建表达载体，将构建好的表达载体转化E. coliJM109进行菌落PCR验证阳性转化子(含有1737bp条带)，证明sdh/sndh基因已经连接到pET28a(+)上并被转化到E. coli中；将提取的阳性转化子质粒转化E. coli BL21 (DE3)，得到重组菌 E. coli-pET28a_sdh/sndh。重组菌E. coli-pET28a-sdh/sndh的诱导表达及酶活测定固体培养基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10 ;琼脂20，pH 7. 0，121° C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 y g/mL。LB培养基(g/L):酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10 ;pH 7.0,121° C灭菌15min。TB培养基蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸二氢钾2. 31，磷酸氢二钾12. 54，pH 7. 0，121。C 灭菌 15min，卡那霉素终浓度 50 u g/mL, IPTG 终浓度 0. 5mM。培养条件从平板中接种重组菌于25mL的LB培养基中，转接TB培养基，接种量10%,装液量10%，诱导前菌体OD6tltl值为0. 6，添加IPTG至终浓度0. 5mM,于30°C、220rpm进行摇瓶培养，培养时间20h。发酵结束后取10D的菌液离心，以0. IM pH7. 0的磷酸盐缓冲液洗涤两次菌体，然后加入0. 5mL磷酸盐缓冲液超声波破壁处理，将全细胞、破壁上清及破壁沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。分析山梨糖脱氢酶活性的基本反应液由以下组成3ml 0. IM磷酸钾缓冲液(pH7. 0，含 0. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸馏水，在测量之前准备好。取0. ImL破壁后粗酶液加入10 y L的辅酶吡咯喹啉醌(PQQ)30°C孵育lOmin。采用可控温、可实时监测吸光度的分光光度计，用光程0. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反应液，0. Iml浓度为IM的L-山梨糖溶液，混合后30°C预热5min，加入经孵育后的酶液启动反应。一个酶活单位定义为Imin内liimol DCIP被催化还原所需的酶量。DCIP在600nm处的摩尔消光系数为I. 91 X IO4L moF10L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶Km值的测定
配制不同浓度的L-山梨糖溶液，分别为0. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M，按上述酶活测定的检测方法，分别求出每个山梨糖浓度下线性范围内的斜率k，按V= (kX60)/I. 91 XlO4 (单位mol L—1 mirT1)求出反应的初速度v,以初速度的倒数IVvi对L-山梨糖的浓度倒数1/[S]作图得一直线，求出 米氏常数Km值。实验证明此酶促反应光吸收-时间曲线前40s基本呈直线关系，因此试验中可以通过测定反应体系在前40s内的平均速度来代替反应初速度V。L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的体外催化作用取50D菌液离心后用pH 7. 0磷酸盐缓冲液洗涤两次，再重悬于0. 5mL磷酸盐缓冲液中超声波破壁，离心后得到粗酶液，取0. ImL粗酶液，加入IOuL PQQ在30°C下孵育IOmin,再将0. 2mL浓度为IM的L-山梨糖、0. 7mL上述基本反应液在30°C下预热5min，然后加入酶液立即混匀，30°C保温15min后用0. lmL50%的三氯乙酸终止酶促反应，反应液以0. 45 u m 滤膜过滤后进行液相检测Agilent IIOOsystem, RioRad 公司 Aminex HPX-87H 色谱柱；流动相2. 75iimol/L浓硫酸;柱温:35。C ;流速:0. 6mL/min ;进样量5uL ;检测器示差折光检测器。山梨醇脱氢酶及山梨酮脱氢酶在维生素C工业化生产中具有重要价值，因此编码此酶的新的基因的发现对于维生素C生产工艺的改进及用于维生素C重组菌的构建具有重要的意义与价值。
具体实施例方式实施例I表达载体的构建将本实验室对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列扩增后连接到克隆载体PMD19-T vector上，转化E. coli JM109感受态，经过抗生素筛选转化子并进行菌落PCR验证，提取阳性转化子质粒测序，将测序正确的转化子培养后提取质粒，经HindIII及Nde I双酶切回收sdh/sndh基因片段连接到同样经HindIII及NdeI双酶切的pET28a (+)载体上，构建表达载体pET28a (+) -sdh/sndh,将构建好的表达载体转化E. coli JM109感受态，经抗生素筛选转化子并对转化子进行菌落PCR验证，挑取阳性转化子培养后提取质粒，经Hind III及Nde I双酶切后出现1737bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a(+)-sdh/sndh ;将提取的质粒转化E. coli BL21(DE3)感受态，得到重组菌 E.coli-pET28a_sdh/sndh0实施例2L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的表达及其酶活测定将E. coli-pET28a-sdh/sndh 及对照 E. coli_pET28a 分别接种于 TB 培养基中，一组一直培养至结束，另一组当OD6tltl达到0. 6时，加入IPTG至终浓度为0. 5mM诱导L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的表达，培养20h后分别取IOD的菌液12000rpm离心5min，以0. IM pH7. 0的磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后重悬于0. 5mL磷酸盐缓冲液中超声波破壁处理20min，将全细胞、破壁上清及破壁沉淀分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，与E. coli-pET28a对照，重组菌E. coli-pET28a-sdh/sndh出现一条分子量约为60kD的蛋白条带。分析山梨糖脱氢酶活性的基本反应液由以下组成3ml 0. IM磷酸钾缓冲液(pH7. 0，含 0. 3% 的 Triton X-100)，0. 45ml 2. 5mM DCIP, 4. 95ml 的蒸馏水，在测量之前准备好。取0. ImL破壁后粗酶液加入IOii L的PQQ在30°C孵育lOmin。采用可控温、可实时监测吸光度的分光光度计，用光程0. 5-cm的比色皿，加入以下溶液0. 4ml基本反应液，0. Iml浓度为IM的L-山梨糖溶液,混合后30°C预热5min,加入经孵育后的酶液启动反应,检测反应液在波长600nm处实时的吸光度值，以一定线性范围时间内反应液的吸光度变化斜率计算L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶酶活，计算此山梨糖/山梨酮脱氢酶的酶活为33.6±2. 2/U，一个酶活单位定义为Imin内liimol DCIP被催化还原所需的酶量。DCIP在600nm处的摩尔消光系数为 I. 91 X IO4L moF10实施例3L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的米氏常数Km值的测定分别配制浓度为0. 0625M、0. 125M、0. 25M、0. 5M、1M的L-山梨糖溶液，按上述酶活测定的检测方法，分别在各个山梨糖的浓度下检测反应液的0D_实时变化值，然后分别求出每个山梨糖浓度下线性范围内的斜率k，按V=(kX 60)/1. 91 XlO4 (单位mol -L^1 -min^1)求出反应的初速度V，以初速度的倒数IzVi对L-山梨糖的浓度倒数1/[S]作图得一直线，求出此山梨糖脱氢酶/山梨酮脱氢酶米氏常数Km值为0. 11 ±0. 01mmol/Lo 实验证明此酶促反应光吸收-时间曲线前40s基本呈直线关系，因此实验中可以通过测定反应体系在前40s内的平均速度来代替反应初速度V。实施例4L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶的体外催化作用取50D菌液12000rpm离心5min后以pH 7. 0磷酸盐缓冲液洗涤两次，再重悬于0. 5mL磷酸盐缓冲液中超声波破壁20min，离心后得到粗酶液，取0. ImL粗酶液，加入10 u LPQQ在30°C下孵育lOmin，再将0. 2mL浓度为IM的L-山梨糖、0. 7mL上述基本反应液在30°C下预热5min，然后加入酶液立即混匀，30°C保温15min后用0. lmL50%的三氯乙酸终止酶促反应，反应液以0. 45 y m滤膜过滤后进行液相检测Agilent IlOOsystem, RioRad公司 Aminex HPX-87H 色谱柱；流动相2. 75 u mol/L 浓硫酸；柱温:35。C ;流速0. 6mL/min ；进样量L ;检测器示差折光检测器。通过液相结果计算得消耗L-山梨糖3. 74±0. 2g.L'2-KLG 浓度为 3. 47 ±0. 3g. L_S L-山梨糖的消耗速率为 13. 9 ±0. 8/g(L h)'虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或.2)所示 .1)其核苷酸序列为SEQID NO. I所示核苷酸序列； .2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶活性的核苷酸序列。
2.权利要求I所述基因编码的蛋白质。
3.含有权利要求I所述基因的转基因细胞系。
4.含有权利要求I所述基因的基因工程菌。
5.含有权利要求I所述基因的表达载体或克隆载体。
全文摘要
本发明公开了一种新的L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶基因，该基因具有序列1所示核苷酸序列。其在大肠杆菌表达系统进行了表达，DCIP法检测表达产物具有酶活性，且具有山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶双功能作用，可用于将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)，并且可与本研究中的L-山梨酮脱氢酶协同进行由L-山梨糖至2-KLG的转化。
文档编号C12N9/04GK102703476SQ20121017123
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者刘杰, 周景文, 堵国成, 陈坚, 高丽丽 申请人:江南大学