专利名称：非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法
技术领域：
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及使用方法。
背景技术：
耳聋是最常见的致残疾病和临床遗传病之一，已报道的新生儿发病率达I 3%。， 研究发现，约60%的新生儿耳聋与遗传因素有关，即遗传性耳聋。其中70%左右以常染色体隐性方式遗传。遗传性耳聋由单一基因突变或不同基因的复合突变引起。至今发现的耳聋相关基因已达120余个，具有较高的基因和位点遗传异质性。近年来研究发现GJB2、 SLC26A4等基因是最常见的耳聋相关基因，GJB2上的235delC、299delAT、176dell6，以及 SLC26A4上的IVS7-2A>G、2168A>G等为热点突变位点，病理性携带率和双等位基因突变率均高。针对上述热点突变进行筛查，可以为40%以上的聋病患者明确病因。遗传性耳聋在临床上多表现为重度的感音神经性聋，缺乏有效的临床治疗办法， 因此早期诊断、早期预 防是主要的遗传性耳聋防治办法。产前诊断结合基因检测是一种有效的解决遗传性耳聋发病的技术手段。产前诊断技术的原则为尽可能早地做出诊断，以及尽可能采用安全的介入性产前诊断方法，主要包括侵入性和非侵入性两种方式。侵入性产前诊断以绒毛活检术(chorionic villus samp I ing, CVS)、羊膜腔穿刺术为代表，因其在基因水平上进行诊断，准确率高达99%。传统的产前诊断遗传性耳聋就是运用侵入性产前基因诊断，对胎儿行GJB2、SLA26A4等常见耳聋基因检测。但是由于细胞培养等过程，检测周期长达I 2周，且存在流产、胎儿畸形等风险，目前该技术仅限于高危孕妇的诊断，不利于大范围推广。非侵入性产前诊断有血清学检测、影像学检测、遗传学检测等。血清学和影像学手段由于是针对表象的检查，存在较高的假阳性和假阴性可能；而新兴的遗传学检测主要是对孕妇外周血中的胎儿遗传物质进行基因诊断，准确性高，与侵入性产前诊断方法相比，仅需孕期抽取适量孕妇外周血即可实现检测，避免了流产、胎儿畸形等风险；检测涉及的PCR 技术反应迅速，检测周期仅I 2天；满足产前诊断早期、安全、快速的诊断原则。目前采用非侵入性手段进行遗传检测的方法主要有提取母体外周血胎儿有核红细胞进行检测或者富集母体外周血游离胎儿DNA (cell free-fetal DNA，cf-fDNA)进行检测。前者可以获得胎儿全基因组DNA，但由于胎儿细胞数量少，分离、鉴别与富集技术复杂， 费用昂贵，限制了临床应用，目前仍在实验研究阶段；后者胎儿DNA含量相对较多，在妊娠早期和晚期分别是母血中胎儿细胞DNA的775倍和970倍，少量母体外周血即可满足诊断需要。此外，由于孕早期即可在外周血中检测到cf-fDNA (最早可在受精卵着床后第18天测得)，且分娩后清除迅速，利于孕早期遗传学产前诊断。目前，cf-fDNA已用于RhD血型分析、性别鉴定等临床检测，在染色体病、单基因病诊断方面也有大量探索，效果显著。因此，基于母体血浆cf-fDNA的无创性产前诊断技术可以在基因水平上实现早期、安全、快速的诊断遗传病。对于遗传性耳聋，该技术可以弥补新生儿听力筛查的局限，即经筛查无法发现的迟发型耳聋；可以解决传统耳聋侵入性产前诊断的局限性，即存在流产、 胎儿畸形风险，检测周期长，难以大范围开展等不足；可以筛查人群中携带的隐性突变，做至IJ “未病防病”；为日后胎儿宫内治疗的开展奠定基础。由于孕妇外周血DNA系胎儿与母体游离DNA的混合物，且胎儿DNA含量仅为
3.4 6.2%。母体等位DNA片段可干扰胎儿DNA的检测。因此寻找灵敏度高、特异性好的检测手段成为需要迫切解决的问题。传统的检测手段如限制性酶切片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、单链构象多态性分析(Single Stranded Conformational Polymorphism, SSCP)、变相高效液相色谱分析(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)、质谱分析(Mass Spectrometry, MS) 等操作复杂、花费高昂、准确性差，且不能高通量、大规模的进行基因多态性分析，难以满足临床应用的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及使用方法。本发明的诊断芯片分型技术操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短，成本低，能用于低丰度遗传性耳聋常见突变的检测，在非侵入性产前诊断领域存在巨大潜力。
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本发明的技术方案是通过如下的技术方案实现的，第一方面，本发明涉及一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，包括片基以及固定在片基上的探针，所述探针为SEQ ID NO. I 24所不的核昔酸序列。优选地，所述片基为载玻片、硅片或膜。优选地，所述片基的材质为高分子材料。第二方面，本发明涉及前述基因芯片的制备方法，包括如下步骤片基酸碱预处理，氨基化处理，异硫氰酸化处理，芯片Zip探针设计，Zip探针点样，氨水封闭，即得。第三方面，本发明涉及前述基因芯片的使用方法，包括如下步骤制备样品，多重 PCR扩增，连接酶检测反应，芯片杂交，芯片扫描，获得结果。优选地，所述多重PCR扩增中所用的引物对如下表所示
权利要求
1.一种非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，包括片基以及固定在片基上的探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO. I 24所示的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，其特征是，所述片基为载玻片、硅片或膜。
3.如权利要求I所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片，其特征是，所述片基的材质为闻分子材料。
4.一种如权利要求I所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤片基酸碱预处理，氨基化处理，异硫氰酸化处理，芯片Zip 探针设计，Zip探针点样，氨水封闭，即得。
5.一种如权利要求I所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括如下步骤制备样品，多重PCR扩增，连接酶检测反应，芯片杂交，芯片扫描，获得结果。
6.如权利要求5所述的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片的使用方法，其特征是，所述多重PCR扩增中所用的引物对如下表所示~F7增位点上游引物下游引物35delG5， -CCGCCCAGAGTAGAAGATG-3 5， -AAGAGGACGGTGAGCCAGA-__；__r_167delT5， -GCATTATGATCCTCGTTGTGG 5， -CATAGCCGGATGTGGGAG-3__^__；_299delAT5， -AGCTGATCTTCGTGTCCA-3 5’ -ATCTCCTCGATGTCCTTAM__:__TT-3，_707T>C5， -GGTACTTGGCAGATCCTTTG- 5， -CCTGGAGCAAGAAGCAACAC__^__^_2168A>G5’ -AGCMTGCGGGTTCTTTGA-35’ -CCTTGACCCTCTTGAGATTT__:__CAC-3，_IVS7-2A>G5， -AAGTTCAGCATTATTTGGTTG 5， -CCCCTTGGGATGGATTTA-3__AC-3，__；_176dell6, 5，-ACTTTGTCTGCMCACCCT-35，-CTCATGTCTCCGGTAGGC-3 235delC_^_
7.一种用于非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求I所述的基因芯片。
全文摘要
本发明涉及一种基因诊断技术领域的非侵入性产前诊断高危遗传性耳聋的基因芯片及制备方法；所述基因芯片包括片基以及固定在片基上的探针，所述探针为SEQ IDNO.1～24所示的核苷酸序列；所述基因芯片的使用方法包括如下步骤制备样品，多重PCR扩增，连接酶检测反应，芯片杂交，芯片扫描，获得结果；同时，本发明还涉及包含所述基因芯片的试剂盒；本发明的诊断芯片操作步骤简单，只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应，杂交扫描即可；检测特异性高，稳定性好，该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子，多次试验重复性高；检测时间短；采用通用芯片技术，片基也可通用于其他芯片，成本低。
文档编号C12Q1/68GK102719538SQ20121018542
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者孟梦, 段涛, 秦胜营, 贺林, 霍燃 申请人:上海交通大学, 同济大学附属第一妇婴保健院