专利名称：一株银杏内生球毛壳菌防治植物病原真菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株银杏内生球毛壳菌NO. 04在防治玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)及匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)中的应用。
背景技术：
植物病原菌的抗药性是植物病害化学防治中的一个严重问题，它给多种植物(如农作物、经济作物及园艺作物等)病害的防治带来很大困难。由于化学杀菌剂特别是内吸性杀菌剂长期而广泛的使用，植物病原菌对其抗药性非常突出。需要通过综合防治尤其是与生物防治相结合，来克服其抗药性的问题，从而对植物病原菌进行有效控制。但是，目前生物防治菌多数尚处于研究与开发的初始阶段，远远满足不了生产上植物病虫害防治的实际要求。加之市场上蔬菜、水果中农药残留量的严重超标，不利于绿色食品的健康发展，因此大力开发生物防治菌产品已势在必行。内生真菌的存在具有普遍性和多样性。植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，近年来己成为生物防治菌剂研制开发的热点，而利用拮抗性内生真菌进行生物防治是生态农业可持续发展的一个重要方面。筛选获得具有抑制病原菌活性的内生真菌是利用它进行植物病害防治的基础工作，具有广谱抗病虫害作用的内生菌在生物防治病虫害、促进农业可持续发展中具有极大的应用前景。国内外对真菌性杀菌剂的开发一直给予了很大关注，目前已有20多个属的真菌被用于植物病害的生防实践。毛壳菌属(Chaetomium)主要腐生于植物残体、纸张、土壤、动物粪便和富含纤维素的废旧物品，以产丰富的降解纤维素的酶和具有生理活性的次生代谢产物而著称， 被认为具有潜在生物防治能力的类群。世界上已报道的毛壳菌约300多个种，可拮抗土壤中的某些微生物。Martin和Moore (1954)发现，巴西的各品种燕麦的种子被球毛壳菌(Chaetomium globosum)和螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)侵染后，则对维多利亚长螺孢毒素的作用产生了抵抗力，从而使谷物、燕麦、大麦的幼苗对镰孢属(Fusarium spp.)具有一定的抗性。Walther(1988)尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum schlecht)是引起番茄枯萎病的致病菌，若用毛壳菌与化学杀菌剂PCNB同时使用，番茄枯萎病的发病率由43%降低到22%。终极腐霉(Pythium ultimum)是引起许多植物的种子腐烂和植物粹倒病的病原菌，此病原菌在越冬期以卵孢子和孢子囊孢子的形式在土壤中生存，当条件适宜的时候，在12小时内就可在甜菜种子表面形成菌落，继而危害作物的正常生长。甘蔗枯萎病是由于甘鹿种子被甜菜莖点霉(Phoma botae)污染、土壤被终极腐霉(Pythium ultimum)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)污染所引起的，Pietro (1992)用毛壳菌的子囊孢子处理甘蔗种子，可以降低甘蔗枯萎病的发生率。同样，棉花枯萎病也是由于棉花种子被终极腐霉(Pythium ultimum)或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)污染而引起的，用毛壳菌的子囊孢子处理棉花种子，可有效控制这两种棉花病原菌所造成的为害。用球毛壳处理南瓜属种子，可以减少因Hylemya platura引起的种子子实体损伤和腐霉菌(Pythium spp.)造成的种子腐烂。如果种子在播种前未用毛壳菌处理，则种子在萌发期间，许多微生物很快定殖在种子表面，而且蝇的卵能够促进种子表面假单胞菌的生长，使假单胞菌成为种子表面的优势菌，从而促进植物病原菌的增殖，继而引起种子腐烂和植物猝倒病的发生。若种子在萌发前用毛壳菌处理，再进行播种，毛壳菌的子囊孢子很快繁殖并在种子表面形成一层厚厚的菌丝，大大抑制了假单胞菌的对数生长，并且不影响种子周围土壤的菌系。另外，Christian (1983) and Daniel (1984)叶面喷洒球毛壳制剂能控制由苹果黑星菌(Venturiainaequ lis)所引起的苹果黑星病,如将球毛壳制剂(5X 106cps/ml)喷洒在苹果叶子上,能减少Venturia inaequlis的孢子数而降低叶子的腐烂程度。由球毛壳产生的抗真菌物质
球毛壳素(Chaetomin)在抑制引起甘鹿粹倒病的病原菌-腐霉菌(Pythium ultimum)方
面起着重要作用。同样，Soytong (2000)毛壳菌对草莓、榴莲和黑胡椒等植物的病原菌均有一定的抑制作用。植物内生真菌产生的次生代谢产物具有丰富的生物学功能和化学结构多样性，在农业和医药业中具有重要的应用潜力，其中一些化合物可能成为药物研发的先导化合物。植物内生真菌已成为寻找具有新颖化学结构及生物活性物质的新资源。
发明内容
本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种
从银杏中分离筛选出的内生真菌---球毛壳菌(Chaetomium globosum)NO. 04 ;本发明的另
一目的是提供利用该菌株及其代谢产物拮抗玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的应用。本发明提供的一株银杏内生球毛壳菌(Chaetomium globosum)NO. 04及其发酵代谢产物，可在防治由植物病原真菌引起的玉米大斑病northern corn leaf blight、葡萄白腐病 Grapevine white rot、番爺根霉果腐病 Tomato rhizopus fruit rot 中应用。一株银杏内生球毛壳菌(Chaetomium globosum) NO. 04及其发酵代谢产物,将一株银杏内生球毛壳菌(Chaetomium globosum)NO. 04接种于发酵培养基中，在25_30°C下发酵培养7-8d，得到的发酵液作为防治植物病原真菌的菌剂。所述的发酵培养基的配方为蒸懼水lOOOmL、燕麦30g、麦芽糖20g,发酵培养基的为 7. O。所述的发酵代谢产物其制备方法包括下列步骤(I)菌种的活化培养将分离保存的一株银杏内生球毛壳菌(Chaetomiumglobosum) NO. 04菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28°C ± 1°C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为9cm打孔器打孔获得菌饼；(2)发酵培养发酵培养液为每蒸馏水IOOOmU燕麦30g、麦芽糖20g，pH为6. 0-7. 0 ;每500mL三角瓶装发酵培养液200mL ;配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取直径为9cm的菌饼，在28°C 土 TC条件下，摇床转速150rpm，发酵培养7-8d ；(3)发酵物提取发酵完毕后离心收集发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取上层，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，供抑菌活性测定。本发明中球毛壳菌的分离筛选与鉴定
于2008年6月在山东临沂采集的银杏叶中，经分离、纯化、培养、发酵和活性测定等步骤获得并保存；经形态学和18SrDNA分子生物学技术,鉴定为球毛壳菌(Chaetomiumglobosum),暂定名为球毛壳菌(C. globosum) NO. 04。该菌株在吉林大学植物科学学院有害生物综合防治实验室保存，保藏日期2010年10月2日，保藏登记号NO. 04。球毛壳菌NO. 04菌株基本培养形态特征为菌落浅色，气生菌丝浅色，有无色或浅橙色分泌物；子囊果表生，球形、卵圆形或倒卵形，有孔口，7d开始成熟，反射光下橄榄褐色或灰褐色；附属丝多，周生，直或微弯曲，褐色，具有疣状突起；子囊棍棒状，簇生，具有8个子囊孢子，具有柄，容易消解；子囊孢子褐色，柠檬形，厚壁，两侧平滑，两端突起，有一个明显的顶生萌发孔。本发明所述的球毛壳菌NO. 04，经发酵可获得对植物病原真菌具有抑制作用的代谢产物。本发明的有益效果一是本发明从植物银杏叶中分离筛选出代谢物对植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的球毛壳菌NO. 04，这为农业上防治玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病等植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；二是本发明提供了利用球毛壳菌NO. 04发酵获得活性代谢产物的方法，该发酵代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
具体实施例方式实施例I :球毛壳菌NO. 04的分离与筛选 本发明于2008年6月在山东临沂采集银杏叶，经表面消毒、内生真菌分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的筛选等步骤，从中获得球毛壳菌NO. 04，保存。球毛壳菌NO. 04抑菌活性测定在PDA平板中央一侧接种直径为9cm的玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉菌块，距离菌块4. 5cm处点接球毛壳菌NO. 04，28°C恒温培养2-4d，观察有无抑菌带，并测定大小，设置不接球毛壳菌NO. 04的处理为对照，抑菌带越大，表示抑菌效果越强。抑制率由下列公式计算抑制率)=(对照组病原菌生长半径一处理组病原菌生长半径)/(对照组病原菌生长半径一原菌饼半径)X 100%测定结果表明球毛壳菌NO. 04对玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的抑制率分别为 61. 00%,59. 08%和 47. 96%。实施例2 :球毛壳菌NO. 04发酵代谢产物的制备方法包括下列步骤(I)菌种的活化培养将分离保存的球毛壳菌NO. 04菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28°C ±1°C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为9cm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；(2)发酵培养发酵培养液为每IOOOmL蒸馏水，燕麦30g，麦芽糖20g，pH
6.0-7. O。每500mL三角瓶装发酵培养液200mL;配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取直径为9cm的菌饼，在28°C ± TC条件下，摇床转速150rpm，发酵培养7-8d ；(3)发酵物提取发酵完毕后离心收集发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取上层，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，供抑菌活性测定。实施例3 :球毛壳菌NO. 04发酵代谢产物对玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的抑制作用所述球毛壳菌NO. 04发酵代谢产物为实施例2所制发酵液。抑菌活性测定取上述发酵液50iU于无菌滤纸片上，并吹干发酵液，在PDA平板中央接种直径为9cm的玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉菌块，距离菌块3cm处点接球毛壳菌NO. 04的发酵液滤纸片，设置将只有发酵培养基并吹干的滤纸片作为阴性对照， 28°C恒温培养2-4d，观察有无抑菌带，并测定大小，以不点接球毛壳菌NO. 04的处理为对照。抑菌带越大，表示抑菌效果越强。抑制率由下列公式计算抑制率)=(对照组病原菌生长半径一处理组病原菌生长半径)/(对照组病原菌生长半径一原菌饼半径)X 100%测定结果表明球毛壳菌NO. 04发酵液对玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的抑制率分别为59. 77%、52. 89%和49. 58%。
权利要求
1.一株银杏内生球毛壳菌Chaetomium globosumNO. 04及其发酵代谢产物，其特征在于在防治由植物病原真菌引起的玉米大斑病northern corn leaf blight、葡萄白腐病Grapevine white rot、番爺根霉果腐病 Tomato rhizopus fruit rot 中的应用。
2.一株银杏内生球毛壳菌Chaetomium globosumNO. 04及其发酵代谢产物,其特征在于将一株银杏内生球毛壳菌Chaetomium globosumNO. 04接种于发酵培养基中，在25_30°C下发酵培养7-8d，得到的发酵液作为防治植物病原真菌的菌剂。
3.按权利要求2所述的一株银杏内生球毛壳菌ChaetomiumglobosumNO. 04及其发酵代谢产物，其特征在于所述的发酵培养基的配方为蒸馏水lOOOmL、燕麦30g、麦芽糖20g。
4.按权利要求I所述的一株银杏内生球毛壳菌ChaetomiumglobosumNO. 04及其发酵代谢产物，其特征在于所述的发酵代谢产物其制备方法包括下列步骤 (1)菌种的活化培养将分离保存的一株银杏内生球毛壳菌ChaetomiumglobosumNO. 04菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28°C ± 1°C条件下培养，至菌丝覆盖整个培养皿，用直径为9cm打孔器打孔获得菌饼； (2)发酵培养发酵培养液为每蒸馏水lOOOmL、燕麦30g、麦芽糖20g，pH为6.0-7. 0 ；每500mL三角瓶装发酵培养液200mL ;配制后121°C灭菌20min，待冷却至40°C在无菌条件下挑取直径为9cm的菌饼，在28°C ±1°C条件下，摇床转速150rpm，发酵培养7_8d ； (3)发酵物提取发酵完毕后离心收集发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取上层，在真空条件下浓缩至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，供抑菌活性测定。
全文摘要
一株银杏内生球毛壳菌NO.04防治植物病原真菌的应用属植物病害生物防治技术领域，本发明提供的一株银杏内生球毛壳菌NO.04及其发酵代谢产物，可在防治由植物病原真菌引起的玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉果腐病中应用；本发明为农业上防治玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病等植物真菌病害病原菌提供了一种微生物菌株；提供的发酵代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
文档编号C12P1/02GK102742605SQ20121018505
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者刘金亮, 张婧赢, 张桂珍, 张艳华, 曲晓艳, 潘洪玉, 秦建春, 莫华文 申请人:吉林大学