专利名称：利用aflp指纹技术鉴定中国对虾种群的方法
技术领域：
本发明属于水产生物种群鉴定分子检测技术领域，具体涉及ー种利用AFLP指纹技术鉴定中国对虾种群方法。
背景技术：
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增长度多态性)是在 RFLP和RAPD技术的基础上发明的一种新的DNA分子标记技木。其基本原理是先利用限制性内切酶将基因组DNA酶切，产生不同大小的DNA片段后，将其用双链人工接头相连接，再以人工接头的互补链为引物进行预扩增，选择性扩增所用引物是在接头互补链的基础上添加1-3个选择性核苷酸，对预扩增模板DNA进行选择性扩增之后，根据扩增片段长度的不同，检测选择性扩增产物的多态性。AFLP分子标记技术自开始应用以来，发展十分迅速，近几年已经 在海洋生物遗传学研究以及在对海洋生物养殖群体和野生群体的种质资源评估等方面得到了广泛的应用。同时，用AFLP方法得到的指纹图谱具有稳定、可靠且多态性丰富等优点，非常适合于种群的鉴定。中国对奸(Fenneropenaeus chinensis)是我国黄、渤海的主要经济奸类。由于中国对虾野生资源的急剧减少，从1986年开始，我国毎年在渤海、黄海北部和山东半岛南部进行人工培育苗种的放流，年放流规模达10亿尾以上。但由于中国对虾的长距离洄游习性，不同地点放流的个体会在越冬场形成混合种群。因此，明确混合种群中中国对虾来源对于渔业资源的管理与保护十分重要。但目前还没有一种有效的鉴定中国对虾种群归属的分子鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供ー种利用AFLP指纹技术鉴定中国对虾种群方法，从而弥补现有技术的不足。本发明的ー个方面是提供一个用于鉴定中国对虾种群的引物组，包括有四对引物，每对引物的正向引物、反向引物的序列分别为SEQ ID NO :1和SEQID NO :2、SEQ ID NO:
I和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。本发明的引物组用于对中国对虾种群进行遗传鉴定，包括有如下的步骤I)样品基因组DNA的提取；2)酶切反应；用EcoR I和Mse I对I)中的DNA进行酶切3)连接反应将2)中获得的酶切产物连接上EcoR I接头和Mse I接头；4)预扩增反应用EcoR I preprimer和Mse I preprimer对3)中获得的连接产物进行预扩增；5)选择性扩增将预扩增产物稀释后，分别用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2、SEQID NO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6 和 SEQ ID NO :7 的引物对进行扩增；且序列为SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6的引物的5'用FAM荧光标记；
6)结果分析将步骤5)的扩增产物用ABI3730条带分型，读取结果后进行种群分析。上述的EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO 9o通过本发明筛选出的引物组合，可以确定自然海域中国对虾种群的来源和归属地，有利于界定不同产卵场对中国对虾种群的贡献值。中国对虾在中日韩共享海域中分布广泛，根据本发明筛选的引物组合能够确定来源于不同产卵水域对共管水域资源的贡献， 界定资源归属比例和应获捕捞配额，对于维护我国海洋权益和保护我国渔业资源具有重要意义。
具体实施例方式本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件来进行操作。申请人:在长期的研究中，通过对不同种群的AFLP分析，筛选到了可以有效的对中国对虾种群进行鉴定的引物对组合，利用本发明的引物组对中国对虾种群进行鉴定，步骤如下I、基因组DNA提取提取中国对虾的全基因组DNA，保存于_20°C备用。2、酶切反应酶切反应体系共20μ L :基因组 DNA 约 100ng、0. 1μ L Trul I (lOu/μΙ)、O. I μ LEcoR I (lOu/μ I)以及 4· Ομ L 10XY+/Tango buffer，加超纯水至 20 μ L，于恒温设备中65°C酶切，时间不少于6h。酶切反应结束后，将反应产物置于75°C中加热15min，使酶失活，4°C保存备用。3、连接反应连接反应体系共IOyL:酶切反应产物5 μ L、ly L的Solution I,O. IyL EcoRIadapter(序列见表 I)、0· I μ L Mse I adapter(序列见表 I)以及 O. I μ L SolutionII (IOu/μ U，加超纯水至10 μ L,室温下反应时间不少于8h,于4°C保存备用。4、预扩增反应预扩增反应体系共20yL:连接产物 lyL、2yL10XPCR buffer、2yL dNTP、O. 05 μ L 的 EcoR I preprimer (序列见表 I)、0· 05 μ L 的 Mse I preprimer (序列见表 I)以及O. 15 μ LTaq DNA聚合酶。预扩增PCR 反应条件94°C 2min，20 个循环(94°C 30s—56°C 60s—72°C 60s)，4°C下保温。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检測。预扩增产物用超纯水稀释10倍，置4°C下保存备用。5、选择性扩增反应在避光条件下，选择性扩增体系20 μ L :5 μ L预扩增稀释混合液、2 μ LIOXPCRbuffer plus Mg2\2y L dNTP,O. 05 μ L EcoR I 引物(5，端添加 FAM 荧光标记)(序列见表1)、0. 05yLMse I引物(序列见表I)，O. 15 μ LTaq DNA聚合酶，加超纯水至总体积为
20 μし
PCR 反应条件先 94 V 2min,再 94 V 30s,65 V 30s, (Touch down 至 56 °C ),72°C 60s, 10个循环后变为94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 26个循环。反应结束后用2%琼脂糖电泳检测选择性扩增效果，并将产物浓度稀释到Marker亮度的1/10。扩增反应产物4 °C保存备用。6、ABI373O 条带分型将浓度调整后的选扩增产物转移到96孔板中，按照每个反应中9 μ L稀释产物、O. I μ L 内标(LIZ_500Size Standard, Applied Biosystems)及 O. 9 μ L Hidi 甲酸胺进行混合。后将上述混合物至于_20°C冰中冷却5分钟后，迅速转移至95°C加热，使混合物彻底变性。最后，将载有混合物的96孔板置于ABI3730测序仪中进行分型。7、运用Genemapper 4. O进行条带读取与分析。表I本发明引物序列信息
权利要求
1.用于鉴定中国对虾种群的引物组，其特征在于，包括有四对引物，每对引物的正向引物、反向引物的序列分别为SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7。
2.权利要求I所述的引物组的应用，是用于对中国对虾种群进行遗传鉴定。
3.如权利要求2所述的遗传鉴定，包括有如下的步骤 1)样品基因组DNA的提取； 2)酶切反应；用EcoRI和Mse I对I)中的DNA进行酶切 3)连接反应将2)中获得的酶切产物连接上EcoRI接头和Mse I接头； 4)预扩增反应用EcoRI preprimer和Mse I preprimer对3)中获得的连接产物进行预扩增； 5)选择性扩增将预扩增产物稀释后，分别用SEQID NO :1和SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ IDNO 6 和 SEQ ID NO 7 的引物对进行扩增；且序列为SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6的引物的5'用FAM荧光标记； 6)结果分析将步骤5)的扩增产物用ABI3730条带分型，读取结果后进行种群分析。
4.如权利要求3所述的遗传鉴定,其特征在于,所述的EcoRI preprimer和Mse Ipreprimer 的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9。
全文摘要
本发明涉及一个用于鉴定中国对虾种群的引物组，包括有四对引物，每对引物的正向引物、反向引物的序列分别为SEQ ID NO1和SEQ IDNO2、SEQ ID NO1和SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。通过本发明筛选出的引物组合，可以确定自然海域中国对虾种群的来源和归属地，有利于界定不同产卵场对中国对虾种群的贡献值。中国对虾在中日韩共享海域中分布广泛，根据本发明筛选的引物组合能够确定来源于不同产卵水域对共管水域资源的贡献，界定资源归属比例和应获捕捞配额，对于维护我国海洋权益和保护我国渔业资源具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102676687SQ20121018662
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者张朝晖, 张辉, 李鹏飞, 高天翔 申请人:中国海洋大学