实验动物长爪沙鼠遗传质量检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明以群体遗传学理论为依据，通过种间转移扩增法从小鼠微卫星位点中筛选出长爪沙鼠微卫星位点，然后经过分级筛选、优化组合，最终优选出了适于长爪沙鼠遗传检测的微卫星位点，建立了适用于长爪沙鼠遗传检测的方法。本发明还采用筛选出的微卫星位点对国内的长爪沙鼠群体进行了群体内遗传变异和群体间遗传差异分析。
【专利说明】实验动物长爪沙鼠遗传质量检测方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及实验动物遗传质量检测方法及其应用，具体为实验动物长爪沙鼠遗传质量检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)属于卩齿齿目、沙鼠属(Gerbillus)动物，又名黄耗子、砂耗子、长爪沙土鼠、蒙古沙鼠(Mongolian gerbil)等，是源自我国的实验用动物。由于长爪沙鼠许多特殊的生物学特性，在许多方面可作为生物学和医学研究的动物模型，并极具发展潜力，具有重要开发价值，是当今实验动物科学发展最为迅速的领域之一。目前长爪沙鼠已在脑缺血、脑神经、寄生虫病、微生物、生殖、内分泌、营养、代谢及药理、肿瘤等研究中广泛应用。
[0003]在我国，长爪沙鼠的实验动物化始于1978年和1985年，由浙江省实验动物中心和首都医科大学分别从野外捕获沙鼠进行驯化研究，成功的培育了两个封闭群群体，并对其生物学特性、染色体组型等进行了研究，在长爪沙鼠实验动物化研究方面奠定了较好的基础。目前我国有四个较大的长爪沙鼠封闭群，分别分布在北京(首都医科大学)、杭州(浙江省实验动物中心)、大连(大连医科大学)和广州(广州医学院)，这些生产单位的长爪沙鼠在国内得到广泛应用。在群体遗传学方面，杜小燕等[1]从小鼠的微卫星位点扩增沙鼠基因组DNA获得长爪沙鼠微卫星位点，并对首都医科大学长爪沙鼠群体、野生长爪沙鼠群体和浙江长爪沙鼠群体进行了群体遗传结构对比分析，表明首都医科大学群体变异程度比以前要高，虽然低于两个野生群体，但差异不是很大。丁贤明等[2]用17个微卫星DNA标记对Z:ZCLA长爪沙鼠封闭群、野生群和近交系进行遗传多样性分析，结果表明Z:ZCLA封闭群和野生群都表现为中度多态，Z:ZCLA封闭群较野生群稍低；3个长爪沙鼠近交系品系基本符合近交系的要求，微卫星标记技术适用于近交系长爪沙鼠的遗传检测。刘月环等M用已知的9个微卫星对浙江省沙鼠群 体进行了遗传多样性分析，结果表明该群体处于不平衡状态。孙贺娟等[4]用筛选的28个生化基因位点对浙江省实验动物中心群体和首都医科大学群体进行了群体遗传结构对比分析，表明两群体内均未出现明显的遗传分化现象，但群体均偏离了哈迪-温伯格平衡；而两群体间并未出现明显的遗传分化。国外有关长爪沙鼠的群体遗传方面的研究报道也比较少，Neumann K等[5]通过用克隆方法找到的9个微卫星位点对野生长爪沙鼠和人工饲养的长爪沙鼠进行了多态性分析，发现人工饲养群体的遗传多态性较低。Yoshda等[6]比较了长爪沙鼠与人及大鼠编码肝、胰及血白蛋白cDNA序列的差异。Shimizu等m通过乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶的电泳分析表明在毛色表型之间无遗传多态性。Okumura等M用23个蛋白酶位点研究了日本培育及保种的4个品系(MGS/Sea、Mon/JmsGbs、KML和Hos)的生化基因位点及遗传变异性，结果除在肝酸性磷酸酶(Acp2)位点有多态性外，其它位点均未见多态性，表明在日本实验长爪沙鼠的群体内和群体间缺乏遗传多样性。
[0004]长期以来，人们一直注重研究长爪沙鼠的保种、生物学特性、遗传结构和开发应用，而对长爪沙鼠的标准化，尤其是遗传质量标准研究不够。目前国家尚没出台长爪沙鼠遗传质量的国家标准，各地方也没有成熟的长爪沙鼠遗传质量地方标准。因此，研究建立长爪沙鼠遗传质量检测方法和遗传质量标准就显得尤为迫切。
[0005]长爪沙鼠的遗传质量对医学生物学研究结果的准确性、重复性及科学性有重要影响，而遗传质量监测是评价和保证实验用长爪沙鼠质量不可或缺的措施。因此，在长爪沙鼠实验动物化过程中遗传检测是极其重要的。遗传检测的目的是为了证实各品种品系应具有的遗传特性，以及是否发生遗传突变和遗传污染等，以确保被监测的样品符合该品种品系的要求。由于品系特性易受许多因素的影响而发生变化，并可直接影响试验结果的可靠性，使用遗传污染的动物所进行的实验，往往导致错误的结论，因此对我国的长爪沙鼠群体进行遗传检测具有重要意义。遗传检测的方法较多，有生物化学标记基因检测法、免疫学性状标记基因检测法、DNA多态性法等。其中微卫星DNA检测法是DNA多态性法的一种，由于具有很多的优点，是近几年来发展较快的一种检测方法。
[0006]微卫星(Microsatellite)，又称简单序列重复(Simplesequence repeats，SSR)，是指以少数几个核苷酸(一般为2~6个)为重复单位组成的简单多次串联重复序列[9]。在真核生物中大约每隔10-50kb就存在I个微卫星_，且它们广泛存在于染色体几乎所有区域[11]。微卫星标记按其核心单位的碱基数可分为单、2、3、4、5、6核苷酸微卫星。人和动物的微卫星重复单位较为常见的是(TG)n和(CT)n[12];按微卫星自身结构，Webertl3]将微卫星分为完全、不完全和复合微卫星:完全型微卫星是由不中断的重复单位串联而成；不完全微卫星是指重复单位间有3个以下的非重复碱基间隔，且两间隔间重复单位连续重复数不低于3 ;复合微卫星是指由几类串联重复单位构成，中间有3个以下碱基间隔，且重复单位连续重复数不低于5。微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成，保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。利用微卫星DNA侧翼序列设计引物进行PCR扩增，由于重复次数的不同形成片段长度不同，经电泳分离，成像表现出不同的电泳带型。
[0007]微卫星DNA具有丰富的多态性、遗传连锁不平衡现象、数量多分布均匀、易检测、重复性好、省时，适于自动化分析和在相关物种之间具有保守性等特点而广泛应用于生命科学的研究中。主要表现在以下几个方面:(I)构建基因图谱微卫星是一种共显性标记，其遗传分析过程相对简化，不仅利于作图群体间标记转换[14]，而且也便于从遗传图谱向物理图谱过渡[15]。(2)制作DNA指纹图，微卫星最早应用之一就是制作DNA指纹图来进行个体、品种(系)鉴定。(3)定位功能基因和数量性状基因座(QTL)利用微卫星与某些功能基因或QTL间的连锁关系，可将一些功能基因或QTL定位在染色体上或连锁群中，这方面的研究在家畜(禽)中已有一些利用。(4)进行血缘鉴定和血缘控制，在育种中，系谱记录是十分重要的，最早用于血型和血液蛋白多态性分析，但因多态性不够丰富而让位于DNA指纹技术。(5)用于群体遗传多样性、遗传结构及起源的研究，Nei等_(1994)认为，用微卫星估计亲缘关系较近的群体间的遗传距离、绘制系统发育树时，比其它的遗传标记技术更精确和闻效。
[0008] 鉴于上述微卫星标记的优点，以及国内外鲜于报道的有关长爪沙鼠微卫星位点，在GenBank和EMBL等国际知名的大型生物学数据库中目前还查不到长爪沙鼠的基因组相关的序列，能查到的微卫星位点仅有9个，且该9个位点在人工饲养群体中的多态性较差，因此目前长爪沙鼠可用的微卫星位点相当有限。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是建立长爪沙鼠遗传质量检测方法，进而有助于长爪沙鼠遗传质量标准的建立，从而规范长爪沙鼠的生产和应用。对长爪沙鼠的群体遗传结构进行全面、客观、公正的评价，查清长爪沙鼠的遗传概貌、特点，为实现我国长爪沙鼠的实验动物化和资源保存，为提出长爪沙鼠质量控制标准及相应技术规范奠定基础。遗传质量检测技术和标准建立，也将进一步丰富和完善我国实验动物质量标准体系，为我国制定动物源性生物技术药物的质量控制标准和相关规范提供支撑。
[0010]为实现上述目的，本发明以群体遗传学理论为依据，在汇集国内外文献资料的基础上，通过对长爪沙鼠微卫星位点进行筛选、组合与优化，建立了适用于封闭群长爪沙鼠遗传检测的方法，并运用筛选出的微卫星位点组合对国内几个长爪沙鼠群体进行遗传多样性分析。
[0011]—方面,本发明参考相关文献从GenBank中共挑选出536个小鼠微卫星位点，进行引物合成。首先摸索并进一步优化这些位点的PCR扩增条件；536个微卫星位点中经过条件优化后，获得313个扩增条带清晰明亮、少或无杂带的位点，将这些位点克隆测序后获得129个长爪沙鼠微卫星位点，以及微卫星位点大小。在多态性筛选方面，本实验选用1.5%的琼脂糖电泳筛选初步确定等位基因数目。汇集本实验室筛选的129个长爪沙鼠微卫星位点和已经报道的7个长爪沙鼠微卫星位点，共计136个微卫星位点(DXMU39、DXMitl7、D19Mit21、D19Mitll、D19Mit9、D19Mit2、D19Mitl、D18Mit45、D18Mit49、D17Mitl3、D17Mit38、D17Mit42、D16Mit26、D16Mit7、D15Mit34、D15Mitl7、D14Mit6、D14Mit92、DllMit4、DllMit35、DllMit36、DllMit42、DllMitl28、DllMit263、D10Mit66、DlOMit86、D9Mit70、D9Mit55、D9Mit47、D9Mit6、D8Mitl84、D8Mit56、D8Mit35、D8Mit24、D7Mit26、D7Mit33、D7Mit46、D7Mit71、D7Mit227、D7Mit333、D7Ndsl、D6Mit5、D6Mit37、D6Mit52、D6Mit85、D6Mitl39、D5Mit9、D5Mit25、D5Mit34、D4Mitl、D4Mit5、D4Mit7、D3Mit258、D3Mitl30、D3Mit221、D3Mitll7、D3Mitl7、D2Mit76、D2Mit231、D2Mit425、D2Mit525、DlMit428、DlMit432、DlMitll9、DlMit65、D16Mitl70、D12Mitl35、D9Mit323、D9Mit253、D15Mit9、D16Mitl00、D17Mit27、D17Mitl94、DllMit242、D10Mit266、D8Mit46、D7Mitl45、D6Mit339、D4Mit54、D5Mit31、D13M8、D12Mit201、DllMitl63、D17Mitl23、D2Mit22、D2Mitl、D3Mit56、D3Mitl56、D4Mitl23、D6Mit9、D9Mitl20、D10Mit223、DllMitl20、DllMit65、D13Mit246、D14Mitl6、D15Mitl23、D15Mitl24、D17Mit36、DlMitll2、D2Mitl6.1、D3MitlO、D3Mit215、D5Mit367、D6Mit23、D7Mit39、D7Mit76、D8Mit83、D10Mit20、DllMit5、D8Mitl70、DlMit362、D3Mit268、D6Mitl02、D7Mitl90、D8Mitl70、D13Mitl、D13Mit3、D13Mitl71、D16Mitl21、D13Mit216、D15Mit267、D16Mitl08、D16Mitl32、D17Mitl43、D17Mitl94、D17Mit226、D6Mitl02 和 D10Mit90 ;AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941和AF200947)。根据位点的等位基因数、多态性和分布情况，从136个位点中选择出多态性大于 3 的 39 个位点(AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D 16Mit7、D 16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30 、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl、D3Mitl7、D15Mitl7、DllMit42、D17Mitl3、D19Mit9、DllMit4、D4Mit5、D3Mit56、D15Mit267、D6Mit9、D7Mit39)。这些位点均匀分布在染色体上，等位基因数平均3.7个。本发明筛选出的微卫星位点信息含量高，分布广泛，呈高度多态性，适合封闭群长爪沙鼠遗传检测。
[0012]另一方面，本发明利用筛选出的39个微卫星位点分析已知的封闭群长爪沙鼠群体-浙江封闭群长爪沙鼠群体(ZF)、首都医科大学长爪沙鼠群体(CMU)和西北野生长爪沙鼠群体(NW)，利用短串联重复(STR)扫描技术得到该3个群体在39个微卫星位点上的基因型，录入数据，运用Popgene3.2软件进行数据分析。利用观察等位基因数、有效等位基因数、香隆指数、观察杂合度、有效杂合度等指标分析该群体的群体内遗传变异，分析时使用的位点数依次减少，最后找出能够反映该长爪沙鼠群体遗传结构的最少使用位点数量。结果显示:运用28个微卫星位点对各群体的分析结果与39个微卫星位点的分析结果没有显著性差异P > 0.05，据此确定对封闭群做遗传检测所需要的最少微卫星位点数目是 28 个(AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D16Mit7、D16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl)。
[0013]第三方面，本发明采用筛选出的28个微卫星位点分析国内首都医科大学长爪沙鼠群体(CMU)、西北野生长爪沙鼠群体(NW)、浙江封闭群长爪沙鼠群体(ZF)、大连医科大学长爪沙鼠群体(DL)和广州医学院长爪沙鼠群体(GZ)，利用STR扫描技术得到该5个群体在28个微卫星位点上的基因型，录入数据，运用Popgene3.2软件，分别进行了群体内遗传变异和群体间遗传差异分析。群体内遗传变异选用平均观察等位基因数、平均有效杂合度、平均观察杂合度、香隆指数4个分析指标。群体间遗传差异采用奈氏标准遗传距离(Nei’sstandard genetic distance, DS)、群体间遗传分化系数Rst、分子方差分析(Analysisof Molecular Variance，AMQVA)。结果显示五个群体的平均有效杂合度分别是0.6239、
0.6671,0.4185,0.4592,0.3972，表明首医长爪沙鼠群体、西北野生长爪沙鼠群体两个群体均具有较高的群内遗传变异，而浙江封闭群长爪沙鼠群体、大连医科大学长爪沙鼠群体和广州医学院长爪沙鼠群体三个群体的群内变异较低，五个群体的变异程度为广州医学院长爪沙鼠群体<浙江封闭群长爪沙鼠群体<大连医科大学长爪沙鼠群体<首医长爪沙鼠群体<西北野生长爪沙鼠群体。根据群体间遗传分化系数Rst和奈氏标准遗传距离得到的亲缘关系邻接树可以看出广州医学院长爪沙鼠群体与其它群体的亲缘关系较远。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为长爪沙鼠基因组DNA0.8%琼脂糖电泳图， 1-10:为动物编号。
[0015]图2为位点D11MU4测序结果图。
[0016]图3为12只长爪沙鼠在AF200941座位琼脂糖凝胶电泳图，M为50bp Marker, 1-12为动物编号。
[0017]图4为纯合子波形，主波大小172bp。
[0018]图5为杂合子波形，第一个主波大小171bp，第二个主波大小183bp。
[0019]图6为浙江封闭群长爪沙鼠基因组DNA0.8%琼脂糖电泳图。[0020]图7为AF200941位点在西北野生长爪沙鼠群体的扩增条带图片，M为50bpMarker, 1-20为动物编号。
[0021]图8为AF200941位点在西北野生长爪沙鼠群体STR扫描结果带图片。
[0022]图9为浙江封闭群长爪沙鼠基因组DNA0.8%琼脂糖电泳图。
[0023]图10为D2MU22位点扩增条带图片，M为50bp Marker, 1-10为动物编号。
[0024]图11为D17MU38位点扩增条带图片，M为50bp Marker, 1-12为动物编号。
[0025]图12为D7MU71位点扩增条带图片，M为50bp Marker, 1-12为动物编号。
[0026]图13为D2MU22位点STR扫描结果带图片。
[0027]图14为D17MU38位点STR扫描结果带图片。
[0028]图15为D7MU71位点STR扫描结果带图片。
[0029]图16为基于奈氏标准遗传距离Ds的五个品系长爪沙鼠的邻接树，Popl:CMU,pop2:NW, pop3:ZF, pop4:DL, pop5:GZ。
【具体实施方式】
[0030]实施例1
[0031]1.1 方法
[0032]长爪沙鼠微卫星位点筛选实验采用首医长爪沙鼠群体和浙江长爪沙鼠群体，首医长爪沙鼠群体16只、浙江长爪沙鼠群体64只；采取肾组织，放入小无菌塑料袋中，_20°C冰冻保存备用。
[0033]1.1.1长爪沙鼠基因组DNA提取与检测
[0034](I)取长爪沙鼠肾组织约0.1g于匀浆器中，加入1.7ml EDTA-Na2 (pH = 8.0) (NaCl2.19g，EDTA-Na24.47g，用IOM NaOH调至pH = 8.0，加蒸馏水至500ml)溶液，匀浆磨碎。将匀浆好的组织液加入10% SDS 100 μ I至终浓度为0.5%，再加入20mg/ml蛋白酶KlO μ 1，充分混匀后，置于37°C水浴过夜。
[0035](2)加入等体积(2ml)的Tris-饱和酚，充分混匀后(避免剧烈振荡)以12000r/min离心lOmin，含DNA的水相位于上层，含杂质的有机相位于下层。吸取上清液于另一个
试管中，重复2~3次。
[0036](3)向上清液中加入等体积的饱和酹/氯仿(2ml)充分混匀，12000r/min离心IOmin0吸取上清液于另一个试管中，加入等体积的氯仿(2ml)充分混匀，12000r/min离心IOmin0
[0037](4)吸取上清液于另一个试管中，加入饱和NaCl 200 μ I混匀,然后加入3~5ml冷的无水乙醇，混匀，可见絮状沉淀物出现。稍加离心，可见DNA沉淀团，吸出无水乙醇，加入Iml 75%乙醇洗涤两次，吸出乙醇，空气中干燥DNA样品。
[0038](5)视沉淀块大小加入 100 μ I ~200 μ I TE 缓冲液(0.5Μ Tris, 2ml, 0.5M EDTA，
0.2ml，加蒸馏水至100ml)，充分溶解DNA。核酸蛋白分析仪测样品浓度、OD260, OD280以及两者比值。DNA样品-20 0C保存备用。
[0039]1.1.2微卫星引物的选择
[0040]实验选用536个小鼠微卫星位点，以及GenBank中Neumann k等[5]于2001年报道的长爪沙鼠的9个微卫星位点，引物序列参照相关数据(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/)。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司以及北京基诺博实生物技术有限公司合成。
[0041]1.1.3PCR反应以及琼脂糖电泳检测
[0042]使用首医长爪沙鼠群体16个样本基因组DNA作为微卫星位点筛选的PCR扩增模版，筛选出长爪沙鼠微卫星位点；使用浙江长爪沙鼠群体64个样本基因组DNA作为微卫星位点优化筛选的PCR扩增模板，筛选多态性较好的长爪沙鼠微卫星位点。PCR反应体系为15μ 1，其中:10XBuffer 1.5μ 1，上下游引物(lOOpmol/μ I)各 I μ l，4XdNTP IOOymol/L:1μ I, Taq 酶 IU:1 μ I，50_100ng 基因组 DNA:1 μ I，纯水(ddH20):8.5μ1 ;其中，Mg2+的终浓度为1.5~3.0mM。扩增条件:94°C预变性5min，94°C变性30s，退火温度(47~60°C )30s，72°C延伸30s，35个循环后72°C继续延伸7min，扩增产物4°C保存。取扩增产物5μ I经1.5%的琼脂糖凝胶电泳140V，30min，成相拍照。
[0043]长爪沙鼠微卫星位点筛选PCR扩增分为两步:第一步，对首都医科大学长爪沙鼠群体进行PCR扩增，并将PCR产物做克隆测序，筛选出长爪沙鼠的微卫星位点，并确定最佳扩增条件。影响PCR扩增结果的主要因素是Mg2+浓度和退火温度，固定其它因素，Mg2+浓度设为1.5禮、2.01111、2.51111和3.01111 4个梯度，退火温度根据实验室前期经验温度值从47°C~60°C设12个梯度。经琼脂糖电泳后，对条带清晰、只有一条或两条，且条带大小位于微卫星大小范围内的位点进行克隆测序，测序结果符合微卫星定义的记录这个优化的Mg2+浓度和退火温度，并把该位点作为被选位点。第二步，将筛选出的129个长爪沙鼠微卫星位点和GenBank中的7个位点(见表1.1)共136个对浙江长爪沙鼠群体进行PCR扩增，筛选扩增效率高，多态性良好的适用于封闭群长爪沙鼠遗传检测的微卫星位点。将浙江长爪沙鼠群体64个基因组DNA 4个一组，随机分为随机16组混合DNA。选用6个多态性较好的位点筛选多态性好的基因组DNA，用长爪沙鼠微卫星位点对多态性好的基因组DNA进行PCR，PCR产物经琼脂糖电泳后，根据琼脂糖电泳结果，初步判断该位点的多态性，把等位基因数达到3个的位点保留，淘汰等 位基因数量小于3的位点。
[0044]1.2.结果
[0045]1.2.1基因组DNA分析
[0046]两个长爪沙鼠群体的基因组DNA (首医长爪沙鼠群体16个，浙江长爪沙鼠群体64个，总计80个)，经0.8%琼脂糖电泳检测显示完整性好；核酸蛋白分析仪检测所有样品的OD260/OD280值均在1.8~2.0之间。动物编号1-10号的基因组DNA的琼脂糖电泳图如图1。
[0047]1.2.2长爪沙鼠微卫星位点的筛选
[0048]536个微卫星位点中扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测有清晰图带，且只有I条或2条，且扩增结果有较好重复性，测序结果符合微卫星位点特点的位点有129个，将序列测定的结果输入Genbank数据库。表1.1中列出了这些长爪沙鼠微卫星位点对应的小鼠微卫星位点名称及Genbank注册号。其中，完美型微卫星104个(80.62%)，不完美型微卫星25个(19.38% )0把这些位点作为被选位点。
[0049]表1.1 GenBank中的长爪沙鼠微卫星位点名称、注册号及对应的小鼠位点名称
[0050]
【权利要求】
1.一种通过小鼠微卫星位点筛选长爪沙鼠微卫星位点的方法，包括: 获得一个长爪沙鼠群体的长爪沙鼠基因组DNA样品； 从GenBank中挑选小鼠微卫星位点，进行引物合成； 将所述长爪沙鼠基因组DNA作为微卫星位点筛选的PCR模板； 进行PCR扩增，并确定最佳扩增条件； 琼脂糖电泳，筛选条带清晰、无杂带或少杂带的微卫星大小范围内的PCR扩增产物； 对筛选出的PCR产物进行克隆测序； 筛选出长爪沙鼠的微卫星位点。
2.根据权利要求1的方法，其中筛选出长爪沙鼠微卫星位点共129个，分别为DXMit39、DXMitl7、D19Mit21、D19Mitll、D19Mit9、D19Mit2、D19Mitl、D18Mit45、D18Mit49、D17Mitl3、D17Mit38、D17Mit42、D16Mit26、D16Mit7、D15Mit34、D15Mitl7、D14Mit6、D14Mit92、DllMit4、DllMit35、DllMit36、DllMit42、DllMitl28、DllMit263、DlOMit66、D10Mit86、D9Mit70、D9Mit55、D9Mit47、D9Mit6、D8Mitl84、D8Mit56、D8Mit35、D8Mit24、D7Mit26、D7Mit33、D7Mit46、D7Mit71、D7Mit227、D7Mit333、D7Nds 1、D6Mit5、D6Mit37、D6Mit52、D6Mit85、D6Mitl39、D5Mit9、D5Mit25、D5Mit34、D4Mitl、D4Mit5、D4Mit7、D3Mit258、D3Mitl30、D3Mit221、D3Mitll7、D3Mitl7、D2Mit76、D2Mit231、D2Mit425、D2Mit525、DlMit428、DlMit432、DlMitll9、DlMit65、D16Mitl70、D12Mitl35、D9Mit323、D9Mit253、D15Mit9、D16Mitl00、D17Mit27、D17Mitl94、DllMit242、D10Mit266、D8Mit46、D7Mitl45、D6Mit339、D4Mit54、D5Mit31、D13M8、D12Mit201、DllMitl63、D17Mitl23、D2Mit22、D2Mitl、D3Mit56、D3Mitl56、D4Mitl23、D6Mit9、D9Mitl20、D10Mit223、DllMitl20、DllMit65、D13Mit246、D14Mitl6、D15Mitl23、D15Mitl24、D17Mit36、DlMitll2、D2Mitl6.1、D3MitlO、D3Mit215、D5Mit367、D6Mit23、D7Mit39、D7Mit76、D8Mit83、D10Mit20、DllMit5、D8Mitl70、DlMit362、D3Mit268、D6Mitl02、D7Mitl90、D8Mitl70、D13Mitl、D13Mit3、D13Mitl71、D16Mitl21、D13Mit216、D15Mit267、D16Mitl08、D16Mitl32、D17Mitl43、D17Mitl94、D17Mit226、D6Mitl02、D10Mit90。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，PCR反应的上下游引物对分别为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO:13 和 SEQ ID NO: 14,SEQ ID N0:15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17 和 SEQ ID NO: 18,SEQID NO:19 和 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 和 SEQID NO:24,SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:29 和 SEQID NO:30, SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33 和 SEQID NO:34、SEQID NO:35和 SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37和 SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39和 SEQ IDNO:40、SEQ IDN0:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44、SEQ ID N0:45 和 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49 和 SEQID NO:50、SEQID NO:51 和 SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55 和 SEQ IDNO:56,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59 和 SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61 和 SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63 和 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:66、SEQID NO:67 和 SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69 和 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 和 SEQ IDNO:72, SEQ ID NO:73 和 SEQ ID
4.一种对长爪沙鼠群体进行遗传检测的方法，所述方法包括: 获得长爪沙鼠基因组DNA样品； 选用适合于长爪沙鼠群体遗传检测的微卫星位点的引物，以长爪沙鼠基因组DNA样品为模板，进行PCR扩增； 琼脂糖电泳检测扩增产物； 短串联重复扫描检测； 利用统计学分析方法分析群体内的遗传变异性、群体间的遗传距离。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述群体内遗传变异选用的分析指标为平均观察等位基因数、平均有效杂合度、平均观察杂合度、香隆指数；所述群体间遗传距离采用奈氏标准遗传距离、群体间遗传分化系数Rst、分子方差分析。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中选用39个微卫星位点，包括权利要求2中所筛选的 32 个位点:D16Mit7、D16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl、D3Mitl7、D15Mitl7、DllMit42、D17Mitl3、D19Mit9、DllMit4、D4Mit5、D3Mit56、D15Mit267、D6Mit9 和 D7Mit39 ； 以及已知的 7 个位点:AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947。
7.根据权利要求6所述的方法，其中PCR反应的上下游引物分别为SEQID NO:261和SEQ ID NO:262,SEQ ID NO:263 和 SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265 和 SEQ ID NO:266、SEQID NO:267 和 SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269 和 SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271 和 SEQID NO:272, SEQ ID NO:273 和 SEQ ID NO:274、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO: 28、SEQID NO:，25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO :223 和 SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:63 和 SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85 和 SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:159 和 SEQID NO:160,SEQ ID NO:163 和 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO:169 和 SEQ ID NO: 170、SEQ IDNO:195 和 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:75 和 SEQID NO:，76,SEQ ID NO:115和 SEQ ID N0:116、SEQ ID NO:107和 SEQ ID NO: 108,SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:3 和 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:63 和 SEQ ID NO:64、SEQ ID N0:49 和 SEQ IDNO:50、SEQID NO:233 和 SEQ ID NO: 234,SEQ ID NO:113和 SEQ ID NO: 114、SEQ IDNO:31 和 SEQ IDNO:32,SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44,SEQ ID N0:19 和 SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:101 和 SEQID NO:102、SEQ IDNO:173 和 SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO:243 和 SEQ ID NO:244、SEQ IDNO: 93 和 SEQ ID NO:，94、SEQ ID NO:211 和 SEQ ID NO:212。
8.根据权利要求6所述的方法，其中选用28个微卫星位点AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D 16Mit7、D 16Mit26、D lMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66和 D13Mitl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，PCR反应的上下游引物分别为SEQIDNO:，261 和 SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263 和 SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265 和 SEQ IDNO:，266,SEQ ID NO:267 和 SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269 和 SEQ ID NO:270,SEQ IDNO:271和 SEQ ID NO:272,SEQ ID NO:273 和 SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:27和 SEQ IDNO:28,SEQID NO:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:223 和 SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:63 和 SEQ IDNO:64,SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85 和 SEQ ID NO:86、SEQID NO:159 和SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:163 和 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO:169 和 SEQID NO: 170、SEQID NO:195 和 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:75 和 SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:115 和 SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:107 和 SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22、SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:63 和 SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:49 和 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:233 和 SEQ ID NO:234。
10.根据权利要求4所述的方法的应用，用于进行长爪沙鼠群体内遗传变异和群体间遗传差异分析。
【文档编号】C12Q1/68GK103484452SQ201210195672
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月14日 优先权日:2012年6月14日
【发明者】陈振文, 杜小燕, 路静, 萨晓婴, 贺争鸣, 王超, 李长龙 申请人:首都医科大学